Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Proteomika kliniczna to ważna, nowa dyscyplina, która daje nadzieję na odkrycie biomarkerów przydatnych w wczesnej diagnostyce i prognozowaniu chorób. Przedstawiamy tutaj nową metodę cyfrowej mikroprzepływowości (DMF), integrującą kilka etapów przetwarzania stosowanych w proteomice klinicznej, w tym ekstrakcję białek, resolubilizację, redukcję, alkilację oraz trawienie enzymatyczne. DMF wykorzystuje dyskretne mikrokrople białek z próbki na macierzy elektrod i może być prowadzona w temperaturze pokojowej, co umożliwia zautomatyzowaną analizę równoległą wielu próbek.

Niniejsza metodologia stanowi znaczący postęp w stosunku do metod konwencjonalnych i ma potencjał, aby stać się użytecznym nowym narzędziem w proteomice klinicznej. Cześć, jestem Steve Sche z laboratorium profesor Erin Wheeler w Departamencie Chemii oraz Instytucie Biomateriałów i Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Toronto. Cześć, nazywam się Gabriel i jestem z laboratorium Wheeler na Uniwersytecie w Toronto.

Jestem Vivian Luke, również z laboratorium Wearer na Uniwersytecie w Toronto. Jestem Erin Wheeler. Mam przyjemność współpracować ze Steve'em Mace'em i Vivian.

Dzisiaj przedstawimy procedurę przetwarzania proteomicznego z wykorzystaniem cyfrowej mikrofluidyki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania białek i próbek biologicznych. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Rozpocznij procedurę w wyciągu, czyszcząc podłoża szklane w roztworze Piranha. Przy zachowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej, należy pamiętać, że roztwór Piranha składa się z trzech części stężonego kwasu siarkowego i jednej części 30% nadtlenku wodoru, dlatego podczas pracy z nim należy zachować szczególną ostrożność.

Inkubuj szklane podłoża w roztworze piranha przez 10 minut, a po oczyszczeniu przepłucz je wodą dejonizowaną lub destylowaną i wysusz podłoża strumieniem azotu. Umieść podłoża w komorze do naparowania wiązką elektronów w celu nałożenia warstwy chromu o grubości 250 nanometrów. Wyjmij podłoża z komory po osiągnięciu tej grubości i przepłucz izopropanolem, a następnie wysusz na płycie grzejnej przez pięć minut w temperaturze 115 stopni Celsjusza.

Przygotuj wysuszone podłoża, nakładając heksametylodysilazan (HMDS) metodą spin coatingu przez 30 sekund. Ponownie wykonaj spin coating przy 3000 RPM, stosując fotorezyst Shipley S 1811 przy użyciu tych samych parametrów.

Wykonać wstępne wypalanie podłoża bezpośrednio na płycie grzewczej w temperaturze 100 °C przez kilka minut. Następnie nałożyć wzór na fotorezyst poprzez naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym lub UV przez pięć sekund przez fotomaskę. Następnie wywołać naświetlone promieniami UV podłoża w wywoływaczu Shipley MF 3 21, używając ilości wystarczającej do całkowitego zanurzenia podłoża, i pozostawić na trzy minuty.

Opłucz podłoże w wodzie DI. Wypal bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez jedną minutę. Traw chrom wystawiony na działanie odczynnika, zanurzając podłoża na 30 sekund w ilości trawia do chromu wystarczającej do ich całkowitego przykrycia.

Opłukać podłoża wodą dejonizowaną (DI), a następnie zanurzyć w preparacie do usuwania fotorezystu Z 300 T w ilości wystarczającej do całkowitego przykrycia podłoża na 10 minut, aby usunąć pozostałości fotorezystu. Opłukać wodą DI i osuszyć strumieniem azotu.

Po tej aplikacji, na podłoże naniesiono warstwę izolacyjnego polimeru Paraline C o grubości od dwóch do pięciu mikrometrów metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej, a następnie naniesiono 50 nanometrów Teflon AF w celu nadania powierzchni właściwości hydrofobowych, poprzez spin coating roztworu 1% w/w we fluorinert FC 40 przy 2000 RPM przez 60 sekund na podłoże.

Powtórz procedurę, używając niepowlekanej płytki szklanej z tlenkiem indu i cyny (ITO), aby stworzyć górną płytę urządzenia. Wypiecz oba podłoża na płycie grzejnej w temperaturze 160 °C przez 10 minut, aby przygotować cyfrowe urządzenie mikrofluidyczne.

Usuń powłoki polimerowe z padów kontaktowych dolnej podłoża, zeskrobując je skalpelem. Połącz odsłonięte pady dolnej podłoża z 40-pinowymi złączami, a następnie uruchom komputer z zainstalowanym programem LabVIEW. Używamy własnoręcznie zbudowanej skrzynki sterującej, która zawiera przekaźniki z sygnałami sterowanymi przez dpad.

Skrzynka sterowania komputerowego umożliwia użytkownikowi kontrolę nad przyłożeniem sygnałów o wartości 100 V RMS przy częstotliwości 18 kHz do urządzenia za pomocą 40-pinowych złączy. Należy również włączyć generator funkcji i wzmacniacz. Złożyć urządzenie, umieszczając dwa kawałki taśmy dwustronnej o całkowitej grubości 140 µm na krawędziach dolnego podłoża.

Pipetuj 4 µL wodyy dejonizowanej do jednego z zbiorników i zamknij urządzenie, umieszczając niewzorcowaną płytkę z tlenku indu i cyny na górze urządzenia, stroną pokrytą teflonem do dołu. Podłącz złącze uziemiające do górnej płyty. Uruchom stworzony w laboratorium program inicjalizacyjny w LabVIEW, aby skalibrować sterowanie sprzężeniem zwrotnym; urządzenie jest teraz gotowe do przeprowadzenia eksperymentów.

W niniejszym protokole wykorzystamy albuminę surowicy bydlęcej lub BSA jako próbkę białka, aby zademonstrować konstrukcję i zastosowanie naszego układu cyfrowej mikrofluidyki. BSA jest rozcieńczona w buforze roboczym lub WB, składającym się z 100 mM Tris-HCl pH 7.8 z dodatkiem 0,08% w/v nioninu F-127. Należy przygotować jeden mililitr każdej próbki oraz roztworu odczynnika i oznaczyć zbiornik, do którego zostaną one wprowadzone.

Po przygotowaniu odczynników należy zdjąć górną płytkę z urządzenia i nanieść pipetą 4 µL roztworu do przypisanego zbiorniczka. Po napełnieniu zbiorniczków należy ponownie nałożyć górną płytkę na urządzenie. Do wykonania następnych kroków należy użyć wewnętrznego programu LabVIEW.

Należy pamiętać, że interfejs komputerowy umożliwia użytkownikowi dozowanie kropli o objętości około 600 nanolitrów z rezerwuarów oraz manipulowanie nimi na macierzy elektrod. W pierwszej kolejności dozuj kroplę próbki zawierającej białko z R1 oraz kroplę osadznika z R2. Połącz obie krople i inkubuj połączoną kroplę przez pięć minut, aby białka wytrąciły się na powierzchni.

Przesuń supernatant z miejsca wytrąconego białka do zbiornika na odpady. R trzy, aby wypłukać wytrącone białko, dozuj trzy krople buforu płuczącego z R cztery i przesuń je przez wytrącone białko do zbiornika na odpady. Pozostaw osad do wyschnięcia, a następnie dozuj kroplę buforu resuspensującego z R pięć na białko.

Pozostaw bufor do inkubacji przez 20 minut, aż osad się rozpuści. Następnie nanieś kroplę reduktora z kanału R6 i połącz ją z kroplą próbki. Wymieszaj połączone krople, przemieszczając je po okręgu przez sześć elektrod.

Inkubować kroplę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Nanieść kroplę czynnika alkilującego z R7 i połączyć ją z kroplą próbki, a następnie wymieszać. Inkubować kroplę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem.

Na koniec nanieś kropelkę trypsyny z otworu R8 i połącz ją z kropelką próbki, a następnie wymieszaj. Inkubuj kropelkę przez trzy godziny w temperaturze 37 °C w szalce Petri na płytce grzejnej. Aby zakończyć reakcję, zdejmij górną płytkę i przerwij trawienie poprzez pipetowanie.

Nanieś 0,6 ml 2,5% kwasu trichlorooctowego w wodzie na kropelkę reakcyjną. Oczyść produkt reakcji po zatrzymaniu procesu, odsysając kropelkę próbki bezpośrednio z płyty dolnej. Używając końcówki C 18 zip tip zgodnie z instrukcjami producenta, próbki można teraz rozcieńczyć w razie potrzeby i poddać analizie spektrometrią mas w celu zidentyfikowania białek w próbce przy użyciu tego systemu.

Następnie, przy użyciu spektrometrii mas, zidentyfikowano białka z wartościami prawdopodobieństwa mniejszymi niż 1 × 10⁻³, co odpowiada 99,9% przedziałowi ufności, oraz przy pokryciu sekwencji wynoszącym co najmniej 30%. Zatem DMF jest bardzo użyteczną metodologią do zautomatyzowanego przetwarzania próbek proteomicznych. Przedstawiliśmy dzisiaj, w jaki sposób wykorzystujemy cyfrową mikroprzepływność do ekstrakcji i przetwarzania białek w sposób zautomatyzowany. Metodologia ta stanowi potencjalne rozwiązanie problemu utraty i kontaminacji próbek podczas izolacji i identyfikacji białek.

Mamy nadzieję, że w przyszłości zastosujemy tę metodę w innych aplikacjach biologicznych, w tym w testach immunoologicznych i testach komórkowych. Wykonując tego typu eksperyment, najważniejsze jest, aby pamiętać o czerpaniu z tego przyjemności. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w eksperymentach.