Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej
23 sierpnia 2012
Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie modularnej macierzy białkowej, która nie wymaga etapu oczyszczania, co czyni ją kompatybilną z dowolną biblioteką białek. Osiąga się to najpierw poprzez generowanie syntetycznych genów za pomocą PCR asemblacyjnej. Następnie syntetyczne geny są nanoszone na szkiełka epoksydowe w formie macierzy.
W celu wykonania urządzenia mikrofluidycznego należy użyć PDMS z silikonowymi formami kontrolnymi i przepływowymi. Następnie urządzenie mikrofluidyczne jest wyrównywane względem naniesionego matrycy DNA. Na koniec do urządzenia mikrofluidycznego wprowadzany jest lizat retikulocytów królika, a następnie następuje ekspresja białek.
Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące ekspresję tysięcy białek dzięki fluorescencyjnemu znakowaniu przeciwciałami. Stosowanie techniki opartej na mikroprzepływach niesie ze sobą szereg zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierze białkowe. Wykonujemy mikromacierz DNA, a następnie wykorzystujemy system Cellis do syntezy białek bezpośrednio na urządzeniu.
W związku z tym nie wymagamy oczyszczania białek, a same białka nigdy nie wysychają. Pozostają one świeże przez cały czas trwania eksperymentu. Technika mikrofluidyczna zapewnia również wyższą czułość. Aby wykonać urządzenie mikrofluidyczne, należy poddać silikonowe formy sterujące i przepływowe działaniu par chlorynotrymetylosilanu przez 10 minut, aby ułatwić oddzielenie elastomeru.
Po etapach wypalania przygotować mieszaninę elastomeru na bazie silikonu i utwardzacza w dwóch różnych proporcjach: 5:1 oraz 20:1, odpowiednio dla form kontrolnych i form przepływowych. Wylać PDMS w proporcji 5:1 na warstwę kontrolną. Odgazować warstwę kontrolną i wypalać przez 30 minut w temperaturze 80 °C.
Następnie na warstwę przepływową nałóż metodą spin-coatingu mieszaninę PDMS w stosunku 20:1, wirując z prędkością 2 600 RPM przez 60 sekund, a następnie wygrzej w temperaturze 80 °C przez 30 minut. Powoli oddziel warstwę sterującą od formy, uważając, aby nie oderwać wzoru z SU-8. Następnie za pomocą skalpela wytnij urządzenie wzdłuż jego obrysu i używając tępej igły, wykonaj pod mikroskopem otwory umożliwiające dostęp do kanałów sterujących.
Ręcznie dopasuj warstwę przepływową i sterującą, zaczynając od górnego lewego rogu i pozycjonując zawór przyciskowy na warstwie sterującej na środku komory reakcyjnej. Następnie wyrównaj pierwszy rząd i delikatnie zwolnij warstwę sterującą rząd po rzędzie. Upewnij się, że wszystkie zawory przyciskowe znajdują się na środku komór reakcyjnych, a zawory adresowe i wlotowe przecinają kanały przepływowe w odpowiednim miejscu.
Powtarzaj ten proces lokalnie, aż wszystkie rzędy zostaną wyrównane. Po pełnym wyrównaniu zdejmij wszelkie naprężenia w PDMS, ostrożnie podnosząc go od boków i narożników. Następnie wypal urządzenie przez dwie godziny w temperaturze 80 °C.
Przetnij wzdłuż obwodu i odklej dwuwarstwowe urządzenie od otworów po wybijaniu formy przepływowej, aby uzyskać dostęp do kanałów przepływowych w celu wytworzenia konstruktów DNA dla urządzenia. Przeprowadź reakcję PCR, aby wytworzyć syntetyczne geny składające się z promotora T7, miejsca wiązania rybosomu, otwartej ramki odczytu z różnymi znacznikami epitopowymi na obu końcach oraz terminatora T7. Aby przygotować syntetyczne geny do rozmieszczenia w matrycy, przygotuj mieszaninę glikolu polietylenowego i wodnego roztworu trehalozy. Rozlej 2 µL na każdą reakcję do dołków płytki 384.
Płytka wielodołkowa. Należy przenieść syntetyczne geny do płytki 384-dołkowej. Następnie dodać wodę destylowaną do uzyskania objętości końcowej 20 µL.
Następnie, przy użyciu techniki mikroarray, nanieś serię syntetycznych genów na szklane podłoża pokryte żywicą epoksydową. Pod stereomikroskopem ręcznie wyrównaj urządzenie mikroprzepływowe z macierzą genową tak, aby plamka DNA znajdowała się w środku komór z DNA. Następnie wyrównaj pozostałe rzędy.
Proces kończymy precyzyjnym dostrojeniem całego urządzenia, aby zredukować naprężenia w PDMS i zapewnić jego prawidłowe połączenie z mikrotablicą. Unieś je miejscowo. Na koniec przymocuj urządzenie do szkiełka przedmiotowego poprzez inkubację przez noc na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C.
Barwniki spożywcze zostały użyte w tej sekcji w celu wizualizacji. Zawory w warstwie sterującej są uruchamiane z komputera za pomocą oprogramowania LabVIEW. Skrypt LabVIEW steruje serią mikrozaworów elektromagnetycznych poprzez elektroniczny moduł sterujący.
Blok zaworów elektromagnetycznych jest podłączony do sprężonego powietrza, które kontroluje przepływ i ciśnienie powietrza w zaworach sterujących urządzenia. Używając elastycznej rurki plastikowej o średnicy wewnętrznej 0,02 cala oraz stalowego trzpienia, należy podłączyć urządzenie do bloku zaworów elektromagnetycznych. Rurki należy napełnić wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie wprowadzić trzpień do otworów dostępowych warstwy sterującej.
Należy upewnić się, że każda probówka jest podłączona do odpowiedniego kanału sterującego. Aby aktywować kanały sterujące, należy uruchomić aplikację LabVIEW, ustawić ciśnienie powietrza na 5 PSI, a następnie przyłożyć ciśnienie powietrza, aktywując zawór w skrypcie LabVIEW. Spowoduje to wtłoczenie wody do kanałów sterujących PDMS w celu zidentyfikowania potencjalnego przesłuchu (crosstalk) między kanałami sterującymi w wadliwych urządzeniach.
W pierwszej kolejności napełnij zawory typu „sandwich” oraz zawory adresowe. Gdy wszystkie kanały sterujące i zawory zostaną wypełnione wodą, odpowietrz zawory, aby zablokować znajdujące się pod nimi kanały przepływowe. Wykonaj to najpierw poprzez zwiększenie ciśnienia powietrza do 15 PSI, a następnie w programie LabVIEW za pomocą zestawu przełączników włącz/wyłącz połączonych z poszczególnymi zaworami elektromagnetycznymi.
Aktywuj wszystkie zawory, włączając wszystkie przyciski przełączników, aby upewnić się, że wszystkie zawory są otwarte. Podłącz rurkę do jednego z wlotów przepływu i wprowadź powietrze do urządzenia pod ciśnieniem 4-5 PSI. Pozwoli to na zwolnienie wszelkich przyklejonych zaworów z szkiełka przedmiotowego.
Urządzenie jest teraz przygotowane i gotowe do celów wizualizacji. W tej sekcji do wizualizacji odczynników użyto żółtego barwnika spożywczego, a bezbarwny roztwór reprezentuje hippies; aby ułatwić samoorganizację matrycy białkowej na powierzchni i zapobiec nieswoistej adsorpcji wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego, należy zmodyfikować chemicznie powierzchnię, podłączając najpierw nową rurkę z wymaganym roztworem do jednego z kanałów przepływowych w urządzeniu. Następnie należy podłączyć wolny koniec rurki do rozdzielacza ręcznego i otworzyć przepływ ciśnienia powietrza.
Przenieś 40 µL biotynilowanego BSA do nowej probówki i przepuść około połowy tej objętości przez urządzenie przez 20 minut. Pomiędzy poszczególnymi etapami używaj 50 mM HEPES do wypłukania wszelkich niereaktywnych substratów. Następnie przepuść 25 µL streptawidyny przez 20 minut.
Po nałożeniu biotynilowanej BSA przemyj układ roztworem PBS przez pięć minut, aby oczyścić powierzchnię wokół przycisku, zamknij zawór przycisku, przepuść resztę biotynilowanej BSA, a następnie ponownie przemyj roztworem PBS przez pięć minut. Na koniec, aby stworzyć macierz przeciwciał przeciwko znacznikowi His pod przyciskiem, otwórz zawór przycisku i przepuść 30 µL Penta-his biotyny przez 20 minut, w celu utworzenia macierzy białek na urządzeniu. Otwórz zawory szyjki i przepuść retikulocyty królika.
Szybko wprowadź roztwór reakcji sprzężonej transkrypcji i translacji przez urządzenie do komory z DNA. Następnie zamknij zawory kanapkowe, aby odizolować każdy gen od jego otoczenia, i inkubuj urządzenie na płycie grzejnej przez 2,5 godziny w temperaturze 30 °C. Następnie znakuj koniec terminalny białek przeciwciałem C mix SI three.
Na koniec, przy użyciu skanera do mikromacierzy z laserem o długości fali 532 nanometrów i filtrem emisyjnym 575 nanometrów, określ poziomy białek. Rycina ta przedstawia zmienne poziomy ekspresji białek na macierzy białkowej.
Zazwyczaj 20% biblioteki genów nie wykazuje ekspresji na poziomach wykrywalnych. Poziomy tła określono przy użyciu komór, w których nie naniesiono DNA. W związku z tym sygnały z odpowiadających im komór białkowych wynikają albo z szumu, albo z niespecyficznej adsorpcji przeciwciał znakujących.
Przy prawidłowym przeprowadzeniu weryfikacja urządzenia trwa cztery godziny, a eksperyment z użyciem chipa pięć godzin.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia mikrofluidalne podejście do ekspresji macierzy białkowych, wykorzystując urządzenie z tysiącami komór reakcyjnych sterowanych przez zawory mikromechaniczne. Integracja biblioteki genów wydrukowanej w formie mikroarray umożliwia transkrypcję i translację bezpośrednio na chipie, co prowadzi do uzyskania gotowej do użycia macierzy białkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Ekspresja białek
- Biblioteki genów
Wstęp
- Macierze białkowe są niezbędne w wielu testach biologicznych.
- Tradycyjne metody często wymagają etapów oczyszczania, co ogranicza ich kompatybilność.
- Urządzenia mikroprzepływowe mogą usprawnić proces ekspresji białek.
- PCR montażowy (Assembly PCR) jest wykorzystywany do generowania syntetycznych genów do tworzenia macierzy.
Cel badania
- Aby stworzyć modułową macierz białek bez etapów oczyszczania.
- Aby zwiększyć kompatybilność z dowolną biblioteką białek.
- Aby zwiększyć wydajność ekspresji białek przy użyciu mikrofluidyki.
Zastosowane metody
- Generowanie syntetycznych genów za pomocą PCR z montażem.
- Unieruchamianie syntetycznych genów na szkiełkach epoksydowych w formie macierzy.
- Wytwarzanie urządzenia mikrofluidycznego z użyciem PDMS.
- Wprowadzanie lizatu retikulocytów króлика do urządzenia w celu ekspresji białek.
Główne wyniki
- Pomyślnie stworzono funkcjonalne urządzenie mikroprzepływowe.
- Białka zostały wyekspresjonowane bezpośrednio na chipie bez oczyszczania.
- Metoda wykazała kompatybilność z różnymi bibliotekami białek.
- Skutecznie przeprowadzono transkrypcję i translację na chipie.
Wnioski
- To mikrofluidyczne podejście upraszcza tworzenie macierzy białek.
- Eliminuje ono potrzebę oczyszczania, co zwiększa użyteczność metody.
- Technikę tę można zastosować do różnorodnych bibliotek białek w celach badawczych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta mikrofluidyczna platforma ekspresji białek umożliwia wysokoprzepustowe generowanie macierzy funkcjonalnych białek bez konieczności ich oczyszczania, co eliminuje kluczowe wąskie gardło w walidacji celów i przesiewaniu oddziaływań. Dzięki utrzymaniu białek na chipie w naturalnym, niedenaturowanym stanie, metoda ta pozwala na wiarygodną detekcję oddziaływań białko-białko, białko-DNA oraz białko-RNA. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć, redukując liczbę wyników fałszywie ujemnych wynikających z utraty białek lub ich błędnego zwijania podczas procesu oczyszczania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ekspresję pełnowymiarowych białek z prawidłowym fałdowaniem i modyfikacjami potranslacyjnymi.
- Wartość operacyjna: Eliminuje etapy oczyszczania, co zmniejsza stratę próbki i zwiększa przepustowość przy przesiewaniu bibliotek na dużą skalę.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie ilościowych danych o ekspresji dla tysięcy wariantów równolegle.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Umożliwia generowanie standaryzowanych macierzy białkowych bezpośrednio z matryc DNA, zapewniając spójność między partiami dla powtarzalnych analiz oddziaływań.
- Wartość operacyjna: Integruje układ genów i ekspresję białek na jednym urządzeniu mikroprzepływowym, minimalizując czas pracy manualnej oraz ryzyko kontaminacji krzyżowej.
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie mierzalnych odczytów fluorescencyjnych kompatybilnych ze skanerami mikromacierzy do mapowania oddziaływań o wysokiej gęstości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia szybkie profilowanie oddziaływań białkowych w odniesieniu do celów istotnych dla przebiegu choroby, zidentyfikowanych w uprzednich badaniach omicznych.
- Dostrojenie biomarkerów: Wspiera przesiewowe wykrywanie autoprzeciwciał lub zdarzeń wiązania terapeutycznego z wykorzystaniem próbek pochodzących od pacjentów na macierzach ekspresyjnych antygenów.
- Przedkliniczna redukcja ryzyka: Pozwala na wczesną ocenę wiązania poza celem lub profili reaktywności krzyżowej przed dalszym etapem badań nad kandydatami na leki.
Integracja z potokiem przetwarzania i przepływem pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania – od przygotowania syntetycznej biblioteki genów po przesiewanie interakcji – umożliwiając płynne przejście od identyfikacji celu do walidacji związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ekspresję ułożonych w macierze genów w celu oceny funkcjonalnej aktywności białek bez błędów wynikających z procesu oczyszczania.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, świeże macierze białkowe gotowe do natychmiastowego użycia w biochemicznych lub biofizycznych testach oddziaływań.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty oparte na fluorescencji, które umożliwiają porównanie poziomów ekspresji i powinowactwa wiązania w tysiącach różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy warianty genetyczne z funkcjonalnymi produktami białkowymi, umożliwiając korelację z danymi fenotypowymi lub klinicznymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma mikrofluidyczna może być przeprogramowana za pomocą nowych macierzy DNA, co wspiera iteracyjne kampanie przesiewowe w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez ekspresję białek w stanie natywnym, co redukuje artefakty wynikające z oczyszczania lub denaturacji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia równoległe przetwarzanie tysięcy reakcji na niewielkiej powierzchni, co poprawia wydajność odczynników i przepustowość.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji go/no-go dzięki szybkiemu generowaniu danych o oddziaływaniach dla dużych bibliotek wariantów.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o kompleksowe profile oddziaływań i wierność ekspresji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w wytwarzaniu urządzeń mikroprzepływowych, w tym formowania PDMS i wyrównywania warstw.
- Zależne od dostępu do sprzętu do nanoszenia mikroarrayów w celu generowania macierzy DNA oraz systemów sterowania mikroprzepływowego (np. LabVIEW z zaworami elektromagnetycznymi).
- Wymaga zestandaryzowanych protokołów przygotowania bibliotek genowych, w tym PCR montażowy oraz znakowanie epitopami w celu detekcji.
- Wiąże się z optymalizacją czasów inkubacji i stężeń odczynników (np. lizatu retikulocytów królika, odczynników biotynylowanych) dla konkretnych celów ekspresji białek.
- Ograniczone przez dostępność zaplecza do wytwarzania układów mikroprzepływowych oraz umiejętności techniczne wymagane do precyzyjnego wyrównywania i łączenia warstw.
