Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Witajcie, nazywam się Manuel Ruiz Rubio i reprezentuję Katedrę Genetyki Uniwersytetu w Kordobie w Hiszpanii. Wykorzystujemy organizm C. elegans jako narzędzie eksperymentalne w badaniach nad autyzmem, korzystając z faktu, że jego układ nerwowy został w pełni scharakteryzowany. Badamy mutanty nicieni z defektami w genach zaangażowanych w synapsy neuronalne, które zostały powiązane z autyzmem.

Neureksyny i neuroliginy są cząsteczkami adhezyjnymi błony obecnymi w synapsach. Głowa C. elegans zawiera amfid, narząd zmysłowy nicienia, który pośredniczy w odpowiedziach na różne bodźce, w tym na siłę osmotyczną. Amfid składa się z 12 sensorycznych neuronów bipolarnych z rzęskowatymi dendrytami i jednego aksonu z terminalem presynaptycznym.

Dwa z tych neuronów, nazwane ASHR i ASHL, są szczególnie istotne dla funkcji sensorycznych związanych z osmolarnością, wykrywając rozpuszczalne w wodzie repelenty o wysokim potencjale osmotycznym. Przedstawiamy metodę opartą na pierścieniu fruktozy 4M do pomiaru unikania wysokiego stężenia osmotycznego u mutantów z defektami synaptycznymi u C. elegans.

Aby ocenić wpływ neureksyn i neuroligin na unikanie wysokiego ciśnienia osmotycznego, opisaliśmy odmienną reakcję C. elegans przeciwko mutantom z defektami w genach nrx-1 i nlg-1, stosując metodę opartą na czteromolowym roztworze fruktozy. W dniu doświadczenia należy przygotować czteromolowy roztwór stokowy fruktozy z 1% czerwieni kongowego i całkowicie go rozpuścić w temperaturze pokojowej. Pierścień o średnicy jednego centymetra na płytce NGM należy narysować w centrum stałej pożywki.

Należy użyć 15 µL czerwonego, czteromolarnego roztworu fruktozy. Pozostawić fruktozę do nasiąknięcia w agarze przez około pięć minut; eksperyment powinien być przeprowadzony w sposób ślepy. Płytka z każdym szczepem przeznaczonym do testowania powinna zostać oznakowana przez drugiego eksperymentatora.

Analiza zachowania jest przeprowadzana z wykorzystaniem tych znaczników, które nie są wymagane. Po zakończeniu eksperymentu, około 24 godziny przed przeprowadzeniem testu, należy wybrać larwy w stadium L4 każdego genotypu i przenieść je na płytkę NGM z bakteriami e coli, utrzymując ją w temperaturze 20°C do następnego dnia. Eksperyment należy rozpocząć z młodymi osobnikami dorosłymi.

Umieść pojedynczego nicienia z każdego szczepu wewnątrz kręgu spoczynkowego i obserwuj każde zwierzę, mierząc czas jego reakcji na barierę tikową. Aby uzyskać wiarygodny wynik, należy przeprowadzić test na 10 zwierzętach z każdego szczepu w minimum trzech powtórzeniach eksperymentalnych. Osobniki unikające czerwonego pierścienia sześć razy z rzędu są klasyfikowane jako normalne.

Osobniki opuszczające pierścień w mniej niż sześciu próbach są uznawane za wykazujące defekt w kontroli wrażliwości osmotycznej; w każdym SA należy zastosować szczep kontrolny, a dwa zwierzęta służą jako kontrole pozytywne, ponieważ unikają one bariery pierścienia. Szczepy kontrolne reagują cofaniem się po napotkaniu bariery osmotycznej składającej się z 4M fruktozy. Mutanty z niedoborem neurologicznym wykazują podobne zachowanie w odniesieniu do tego typu stężenia.

Jednakże mutanty z niedoborem NEUR nie były w stanie wykryć tej bariery osmotycznej. Podwójne mutanty z różnymi aktywnymi allelami neur i nout odzyskały fenotyp typu dzikiego, reagując na siłę osmotyczną. W celu uzyskania robaków z wyciszonymi genami poprzez karmienie indukujące interferencję RNA, izoluje się kolonie szczepu E. coli HD115, który został przekształcony wektorem L4440 zawierającym fragment odpowiadający genowi docelowemu. Bakterie izoluje się na płytkach LBA z antybiotykiem następnego dnia.

Wybrać kolonię bakterii i zaszczepić ją w płynnej pożywce LV. Inkubować przez około siedem godzin z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C. Nanieść kroplę tej hodowli na płytkę NGM z pokryciem węglanowym i IPTG, a następnie pozostawić na noc w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wzrost bakterii i rozpoczęcie indukcji ekspresji fragmentu genu docelowego.

Konieczne jest zastosowanie kontroli pozytywnej i nie-negatywnej dla interferencji RNA. Eksperymenty z podawaniem pokarmu. Kontrola negatywna jest taka sama.

Szczepy HT115 przekształcone wektorem pL4440. Kontrole pozytywne to komórki HT115 przekształcone wektorem pL4440 zawierającym sekwencję genu unc-22. Wyciszenie tego genu powoduje fenotyp drżenia, który jest łatwo rozróżnialny pod mikroskopem stereoskopowym.

Pierwszy dzień. Cztery L4 stadium z NGM PLA z bakteriami są przenoszone na płytkę z bakteriami i inkubowane w 20 °C przez 12 godzin. Jest to okres głodzenia.

Następnego dnia przenieś młode osobniki w fazie fast young adult na płytkę zaszczepioną bakteriami wykazującymi ekspresję specyficznego genu docelowego dla interferencji RNA. Pozostaw je na około 48 godzin w temperaturze 20 °C w celu uzyskania potomstwa F1. Następnie w ciągu kolejnych dwóch dni przenieś kilka dorosłych osobników F1 na inną płytkę zaszczepioną tymi samymi bakteriami.

Wybierz i wyizoluj młode osobniki dorosłe z potomstwa F2. Ocena fenotypów szczepu dzikiego Bristol N2 karmionego bakteriami OP50. Wektor L4440 był wprowadzany wstecz w celu przebadania bariery osmotycznej.

Szczep typu dzikiego Bristol i N2 karmiony bakteriami eksponującymi fragment genu nrx-1 z C. elegans nie wykazywał zdolności do wykrywania 4 M roztworów fruktozy. Jednak mutant deficientny w białku NRX-1, niezdolny do wykrywania bariery osmotycznej, odzyskał tę zdolność po podaniu bakterii eksponujących fragment genu nrx-1 z C. elegans. W tym filmie prezentujemy prostą metodę, która pozwala badać wpływ genów oddziałujących na reakcję unikania osmotycznego u C. elegans.

Pierścień roztworu fruktozy z dodatkiem czerwieni Kongo jest wykorzystywany do analizy reakcji nicienia na siłę osmotyczną. Mutanty z niedoborem neureksyn wykazują zaburzenia w tej reakcji, natomiast mutanty nlg nie mają upośledzonej zdolności wykrywania stresu osmotycznego, wykazując odpowiedź podobną do szczepu typu dzikiego. Niniejszy film pokazuje, że szczepy podwójnych mutantów niosące różne allele knockout w genach nrx i nlg odzyskały fenotyp typu dzikiego, reagując na siłę osmotyczną.

Obserwacje te potwierdzono za pomocą interferencji RNA z wykorzystaniem metody podawania przez pokarm. W ten sposób szczep typu dzikiego utracił zdolność rozpoznawania bariery osmotycznej po nakarmieniu bakteriami wykazującymi odpowiednią sekwencję genu ING. Z kolei mutanty z defektem neur, które nie były w stanie wykryć 4M roztworu fruktozy, odzyskały tę zdolność po nakarmieniu bakteriami wykazującymi odpowiednią sekwencję genu NNU.

Wyniki przedstawione w tym eksperymencie wskazują, że nrx-1 i nlg-1 mogą być zaangażowane w połączenia synaptyczne neuronów sensorycznych nicieni, a także że oddziałują one na siebie w sposób wpływający na funkcję synaptyczną. Dziękujemy, do widzenia i powodzenia w Państwa eksperymentach.