Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie profili ekspresji genów leżących u podstaw licznych fenotypów lub szlaków metabolicznych. Osiąga się to poprzez uprzednią izolację mRNA z dwóch kontrastujących szczepów nicieni. Drugim krokiem procedury jest synteza cDNA zawierającego sekwencje przechwytujące S S I three lub SFI i ich hybrydyzacja z mikromacierzą.

Trzecim krokiem procedury jest hybrydyzacja mikromacierzy z sekwencjami anty-wychwytującymi zawierającymi S SI three oraz fluorofory SCIFI. Ostatnim etapem procedury jest skanowanie mikromacierzy i analiza danych przy użyciu narzędzi bioinformatycznych, takich jak oprogramowanie magic tool. W końcowej fazie identyfikuje się geny kandydackie pośredniczące w badanym zjawisku biologicznym, które mogą zostać zwalidowane i ilościowo określone za pomocą alternatywnych technik, takich jak real-time PCR.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ naniesione nukleotydy są niewidoczne dla użytkownika, co utrudnia nałożenie jednorodnej mieszaniny hybrydyzacyjnej na ponad 23 000 unikalnie wydrukowanych nukleotydów. Należy rozpocząć od wyizolowania RNA z zdrowych, zsynchronizowanych nicieni. Najpierw są one przemywane, zawieszone w probówkach o pojemności 15 ml i odwirowane; osady z nicieni są następnie resuspendowane w 7 ml 0,1 M NaCl oraz 7 ml lodowatej, 60% (m/v) sacharozy.

Po 15 minutowej inkubacji w lodzie robaki są ponownie wirowane w celu uzyskania osadu. Obecnie wolne od bakterii nicienie wypłyną na powierzchnię, zostaną zebrane, przemyte wodą wolną od RNaz i ponownie ocenione. Następnie czysty, luźno zbity osad przenosi się do probówki do mikrocentryfugi i wiruje z maksymalną prędkością przez 30 sekund.

Odessać i przechowywać w 10 objętościach odczynnika RNA later w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia dalszych prac. Aby przygotować próbki całkowitego RNA, odwirować przygotowane osady z maksymalną prędkością, odrzucić supernat i dodać do osadu szczyptę molekularnej żywicy rozcierającej. Następnie zamrozić mieszaninę ciekłym azotem i rozetrzeć za pomocą tłuczka.

Rozetrzeć zamrożoną zawiesinę nicieni na drobny proszek, dodając w razie potrzeby ciekły azot, aby utrzymać niską temperaturę proszku po rozcieraniu. Umieścić ekstrakt na lodzie na pięć minut. Po pięciu minutach zmieszać ekstrakt z 700 µL R-L-T-B-M-E oraz 472 µL 100% ethanol.

RNA można obecnie izolować za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu do końcowej objętości 60 µL izolowanego RNA na próbkę biologiczną. Przed przejściem do kolejnych etapów należy usunąć potencjalne zanieczyszczenie genomicznym DNA poprzez traktowanie próbek DNase I, a następnie zastosowanie dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania RNA. Procedurę z zestawu należy zakończyć, dążąc do uzyskania objętości 60 µL.

Na koniec należy oznaczyć stężenie RNA oraz ocenić jego integralność poprzez obróbkę barwnikiem do nakładania próbek z gliksalem i analizę w żelu przed hybrydyzacją mikromacierzy. Przy użyciu konwencjonalnych metod oczyszczone RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA, które następnie oczyszcza się z zdegradowanej matrycy za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu i doprowadza do objętości 60 µL. Hybrydyzację mikromacierzy należy rozpocząć od blokowania szkiełek mikromacierzy za pomocą sonikowanego DNA z plemników łososia. Po godzinie zablokowane szkiełka należy zanurzyć w wodzie dwukrotnie destylowanej i zakręcić w wirówce.

Osusz preparaty w probówkach stożkowych o pojemności 50 ml, wyłożonych chusteczką typu Kimwipe. Następnie przygotuj dwukrotny (2x) bufor do hybrydyzacji na bazie formamidu. Najpierw podgrzej go do 55 °C przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić kryształy.

Następnie odwiruj próbkę przez jedną minutę przy 10 000 gs. Dalej wymieszaj 25 µL CD NA z 25 µL buforu do hybrydyzacji, a następnie delikatnie potrząśnij mieszaniną. Teraz wykonaj krótkie wirowanie mieszaniny i inkubuj ją w temperaturze 80 °C przez 10 minut.

Po inkubacji ostrożnie nanieś całą próbkę cDNA na szkiełko do mikromacierzy za pomocą pipety, uważając, aby nie dotknąć powierzchni szkiełka. W celu równomiernego rozprowadzenia próbki na szkiełku do mikromacierzy, delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe, używając do tego igły strzykawki; zanim nakrywka całkowicie opadnie, unieś ją ponownie i ponownie opuść za pomocą igły, pozwalając szkiełku nakrywkowemu delikatnie osiąść na miejscu.

Technika ta minimalizuje powstawanie pęcherzyków powietrza. Teraz należy umieścić preparat poziomo w probówce stożkowej o pojemności 50 ml, dodać 50 µl wody dwukrotnie destylowanej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia, po krótkim przemyciu preparatu, przeprowadza się drugą hybrydyzację.

W badaniu SSC drugi bufor, zawierający światłoczułe odczynniki przechwytujące oraz odczynnik Antifa, jest aplikowany wielokrotnie przy użyciu tej samej techniki, po czym następuje krótka inkubacja, kolejne etapy płukania oraz suszenie. Następnie preparat może zostać zeskanowany. Obrazy można analizować przy użyciu bezpłatnego oprogramowania z narzędziem open source magic tool.

W zakładce projektu (project tab) utwórz i zapisz nowy projekt. W zakładce budowania profilu ekspresji (build expression profile tab) wybierz opcję załaduj parę obrazów (load image pair), a następnie przypisz plik obrazu czerwonego jako red i plik obrazu zielonego jako green. Następnie przejdź do zakładki budowania profilu ekspresji (build expression profile tab). Wybierz opcję załaduj listę genów (load gene list), aby przesłać plik z listą genów C. elegans pobrany ze strony internetowej GCAT w celu przypisania adresów i siatkowania obrazu mikromacierzy.

Wybierz kartę „build expression profile” (buduj profil ekspresji) oraz opcję „create edit grid” (utwórz siatkę edycyjną). Następnie edytuj siatkę. W oknie dialogowym ustaw liczbę siatek na 48, 22 wiersze i 22 kolumny dla każdej siatki oraz wybierz numerację punktów od lewej do prawej i od góry do dołu.

Zwiększ procentową zmianę kontrastu i powiększ widok siatki, aż poszczególne plamki staną się łatwo rozróżnialne. Utwórz siatki, wybierając opcję „set top left spot” (ustaw plamkę w lewym górnym rogu) w panelu po lewej stronie, a następnie klikając w środek plamki w lewym górnym rogu, następnie w plamkę w prawym górnym rogu i w dolny rząd w pierwszej siatce. Powtórz tę procedurę tworzenia siatek dla każdej z 48 siatek, postępując od lewej do prawej i od góry do dołu.

Następnie zapisz dane, wybierając kartę pliku i opcję zapisz aktualną siatkę (save current grid as). Wybierz kartę ukończone (finished), aby wyeliminować z analizy wszelkie niepowiązane plamy. Otwórz kartę buduj profil ekspresji (build expression profile) i w opcjach adresowania siatki wybierz flagowanie plam (spot flagging).

Następnie należy oznaczyć wszelkie smugi lub fluorescencję tła i zapisać zmiany, wybierając opcję save current flags. W zakładce file należy dokonać segmentacji plików z naniesionymi oznaczeniami. Na koniec, aby przeanalizować geny indukowane lub represowane przez określony czynnik, należy wybrać opcję explore w zakładce expression.

W oknie dialogowym eksploracji ustaw kryteria dopasowania genów. Liczba dwukrotnych wzrostów lub spadków ekspresji. Intensywność jest określana jako x, a wartość X stanowi kryterium zmiany ekspresji.

Wartość X jest wprowadzana jako wartość maksymalna większa niż X dla genów indukowanych oraz wartość minimalna mniejsza niż X dla genów represjonowanych. W tym doświadczeniu przeprowadzono kontrolę z zamianą barwnika (dye swap); dwie niezależne izolacje całkowitego RNA z larw w stadium trzecim i czwartym są hybrydyzowane jako zielony mutant kontra czerwony typ dziki, natomiast w drugiej próbie jako czerwony mutant kontra zielony typ dziki, aby potwierdzić zmiany w ekspresji genów. Wykonaj trzy niezależne izolacje całkowitego RNA stosując tę samą procedurę, zsyntetyzuj cDNA za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu, a dla każdej próbki cDNA przeprowadź reakcję real-time PCR w trzech powtórzeniach, wykorzystując trzy geny housekeepingowe jako kontrole. W ramach demonstracji w poniższych wynikach analizowano indukcję ekspresji genów w VSM one.

Mutanty AK 1468 to szczep nicieni charakteryzujący się zwiększoną liczbą synaps; przed przeprowadzeniem analizy mikromacierzy sprawdzana jest jakość wyekstrahowanego RNA za pomocą elektroforezy żelowej. Obecność dwóch nienaruszonych podjednostek rybosomalnych przed i po traktowaniu DNK-azą I świadczy o dobrej jakości próbki RNA w mikromacierzy; cDNA typu dzikiego jest znakowane na czerwono, a cDNA mutanta VSM 1 na zielono. W jednej z 48 siatek analizowanych w ramach jednej mikromacierzy każdy mały kwadrat reprezentuje pojedynczy naniesiony oligonukleotyd; w każdej macierzy reprezentowany jest każdy unikalny oligonukleotyd.

Po tym, jak analiza mikromacierzy transkryptów wyizolowanych z larw w stadium czwartym wykazała, że geny kodujące główne białka plemników (MSP) są indukowane u mutantów VSM one, analiza mikromacierzy larw w stadium trzecim również ujawniła zmiany w ekspresji w obrębie tej samej rodziny genów u mutanta. Weryfikacja przewidywań z mikromacierzy za pomocą analizy real-time PCR wykazała, że jeden z członków rodziny genów MSP, MS P 32, jest indukowany u mutantów VSM one. Dane reprezentują średnią z trzech powtórzeń real-time PCR z tej samej kolekcji RNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat obsługi narzędzi bioinformatycznych do analizy w skali całego genomu, szczególnie biorąc pod uwagę liczne programy bioinformatyczne o otwartym kodzie źródłowym dostępne dla społeczności naukowej.