Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Celem tego filmu jest zaprezentowanie metody izolacji i identyfikacji RNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych przy użyciu metod immunoprecypitacji. Witam, nazywam się Garrett Dom i jestem doktorantem w departamencie biologii molekularnej, mikrobiologii i immunologii na University of Missouri, gdzie prowadzę badania pod kierownictwem dr. Eli sso. Dzięki postępowi w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym oraz wydajnej analizie mikromacierzy, globalna analiza i badanie ekspresji genów stały się łatwą i powszechnie dostępną formą gromadzenia danych w wielu modelach badawczych i chorobowych.

Niemniej jednak stężenia mRNA genu docelowego w stanie stacjonarnym nie zawsze korelują bezpośrednio z poziomami białek w stanie stacjonarnym. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tej rozbieżności jest potranskrypcyjna regulacja genów, sterowana przez oddziaływania białek wiążących RNA.

Regulacja potranskrypcyjna wpływa na lokalizację, stabilność i translację mRNA poprzez tworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego z docelowymi cząsteczkami mRNA. Identyfikacja nieznanych celów mRNA de novo w tym kompleksie z ekstraktów komórkowych jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów i funkcji białek wiążących RNA oraz ich wpływu na poziom syntezy białek. Niniejszy protokół opisuje metodę zwaną immunoprecypitacją białka rybonukleoproteinowego, lub RIP, która umożliwia identyfikację specyficznych cząsteczek mRNA związanych w kompleksie rybonukleoproteinowym.

Przed rozpoczęciem eksperymentu kluczowe jest zgromadzenie wszystkich odczynników, pojemników i narzędzi. Szklane naczynia należy potraktować inhibitorem RNaz, takim jak RNA ZAP od firmy Ambion, a następnie wypłukać wodą traktowaną DPIC; należy upewnić się, że wszystkie odczynniki są potwierdzone jako wolne od RNaz. Pierwszym krokiem procedury jest wyizolowanie kompleksu rybonukleoproteinowego z lizatu komórkowego; należy zebrać komórki tkankowe w fazie wzrostu wykładniczego, aby uzyskać od 2 mg do 5 mg całkowitego białka dla każdej użytej próbki; zazwyczaj wystarczające są dwie szalki hodowlane P150.

W niniejszym doświadczeniu przeprowadzamy zbiór linii komórkowych raka piersi u ludzi MB 2 31 oraz MC seven, a następnie badamy interakcje rybonukleoproteinowe białka wiążącego RNA. Należy zauważyć, że dla każdego badanego białka wiążącego RNA całkowita liczba komórek oraz ilość białka muszą zostać zoptymalizowane, aby zmaksymalizować odpowiednie interakcje między docelowym mRNA a białkiem wiążącym RNA. Komórki należy odwirować przy 1000 RPM przez około 8 do 10 minut w temperaturze 4°C, a następnie trzykrotnie przemyć lodowatym PBS. Po ostatnim przemyciu należy delikatnie uderzyć w dno probówki i resuspender osad komórkowy w równych objętościach przygotowanego buforu do lizy polisomalnej z inhibitorami RNaz i proteaz.

Zaleca się dokładne odmierzenie objętości osadu komórkowego, delikatne pipetowanie mieszaniny w celu rozbicia skupisk komórek oraz inkubację lizatu na lodzie przez pięć minut. Odwiruj próbkę przy 13 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oczyścić lizat z zanieczyszczeń, a następnie niezwłocznie przenieś oczyszczony nadsącz do schłodzonych wcześniej mikroprobówek do wirowania przeznaczonych do RNA, przechowując je na lodzie i w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Lizat ten można przechowywać do sześciu miesięcy w temperaturze -80 °C. Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ mogą one prowadzić do degradacji białek i/lub mRNA. Zaleca się przeprowadzenie IP niezwłocznie.

Należy szybko oznaczyć stężenie białka w lizacie, wykorzystując standardowy test Bradforda. Następnie należy przygotować materiały do izolacji konkretnego białka docelowego. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić wstępne pęcznienie białka.

Kuleczki Sphero inkubuje się przez noc w buforze NT two uzupełnionym o 5% BSA, przechowując w temperaturze 4°C. Bufor NT two stosuje się w stosunku 4:1 do kuleczek PAS. Możliwe jest długoterminowe przechowywanie do kilku miesięcy w temperaturze 4°C.

W przypadku uzupełnienia o 0,1% azotku sodu przed użyciem, należy usunąć nadmiar buforu NT two, aby końcowy stosunek kulek do buforu wynosił jeden do jednego. Używając probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml wolnych od RNA, należy odobrać 100 µL zawiesiny SRO speed i dodać 30 µg przeciwciała dla każdej pojedynczej reakcji IP. Na przykład w naszym doświadczeniu stosujemy przeciwciało who are, którym jest przeciwciało mysie IgG1.

W związku z tym naszym przeciwciałem kontrolnym jest również przeciwciało IgG. Następnie należy dodać od 100 do 200 µL buforu NT dwa do mieszaniny kulek z przeciwciałami. Dodatkowo, równolegle należy zastosować przeciwciało o tym samym izotypie lub pełne normalne serum z tego samego gatunku jako kontrolę przeciwciał w celu wykluczenia tła RNA.

Dodaj odpowiednie przeciwciało do mieszaniny kulek i inkubuj przez noc, obracając w rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj kulki pokryte przeciwciałami bezpośrednio przed użyciem, przemywając je pięciokrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu NT dwa. Przemywaj kulki poprzez wirowanie przy 13 000 G przez jedną do dwóch minut w temperaturze czterech stopni. Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety ręcznej lub aspiratora.

To płukanie pomaga usunąć niezwiązane przeciwciała, a także zanieczyszczenia RNA z mieszaniny przeciwciał. Po zakończeniu ostatniego płukania, ponownie zawiesić kuleczki w 700 µL lodowatego buforu NT2, a następnie zastosować różne inhibitory RNaz w celu ochrony docelowych mRNA, w tym 10 µL RNazyze, 10 µL 100 mM DTT oraz 15 µL EDTA. Uzupełnić objętość do 900 µL za pomocą buforu NT2.

Następnie przeprowadzimy immunoprecypitację docelowego kompleksu. W celu zredukowania sygnału tła w analizie RNA po procedurze RIP zdecydowanie zalecamy wykonanie etapu wstępnego oczyszczania (pre-clear): inkubować z 15 µg kontroli izotypowej przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 50 µL wstępnie napęczniałych kulek PAS niezwiązanych z przeciwciałem.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy jednoczesnym rotowaniu, a następnie wirować w wirówce przy 10 000 g w temperaturze 4 °C. Odwirować osad. Nadnadczyn zachować do immunoprecypitacji (IP).

Następnie dodaj 100 µL wyizolowanego, oczyszczonego lizatu zawierającego około dwóch do pięciu mg białka do przygotowanej mieszaniny przeciwciał. Rozcieńczenie lizatu pomoże zmniejszyć tło; zamknij probówkę i zaciśnij wieczko (Parafilm), a następnie inkubuj w temperaturze 4 °C przez cztery godziny w warunkach obrotowych. Następnie odwiruj kuleczki przy 5 000 G przez pięć minut w temperaturze 4 °C i zachowaj supernatant do ewentualnej analizy, przechowując go w temperaturze -80 °C, zgodnie z wcześniejszym opisem. Przemyj kuleczki pięć razy 1 mL lodowatego buforu TNT, wirując po każdym razie.

Następnie usunąć supernatant za pomocą pipety ręcznej lub aspiratora. W celu zmniejszenia tła można zastosować bardziej rygorystyczne metody, uzupełniając bufor NT two o dodecylosiarczan sodu, mocznik lub SDS. Próbki należy przechowywać na lodzie tak długo, jak to możliwe, i pracować szybko, aby zminimalizować degradację docelowego mRNA.

Na koniec zastosujemy traktowanie DNazą i proteinazą K, a następnie wytrącanie RNA w celu wyizolowania RNA z rybonukleoprotein; po przemyciu resuspenduj koraliki w 100 µL buforu N NT two uzupełnionego o 5 µL DNazy I wolnej od RNA. Przechowuj próbki w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut. Dodaj 1 mL buforu N NT two i wiruj przy 5 000 ×g przez 5 minut.

Odciąć supernatant, zawiesić osad SROs w 100 µL buforu NT2 z dodatkiem 5 µL proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL oraz 1 µL 10% SDS. Inkubować zawiesinę kulek przez 30 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C, delikatnie potrząsając naczyniem co 10 minut. Proteinaza K wspomaga uwalnianie komponentów rybonukleoproteinowych. Odwirować kulki w celu uzyskania osadu.

Wiruj z prędkością 5 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie zbierz nadsącz, którego objętość powinna wynosić około 100 µl. Następnie do kulek dodaj 200 µl buforu NT 2 i wiruj z prędkością 5 000 G przez dwie minuty. Zbierz około 200 µl nadsączu i odrzuć kulki.

Połączyć supernatant i dodać 300 µL kwasowego fenolu do dolnej warstwy, a następnie wymieszać w wirówce vortex. Inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i wirować z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Zebrać 250 µL górnej warstwy.

Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zakłócić powierzchni rozdziału, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie. Do próbki RNA dodać 25 µL octanu sodu o pH 5,2, 625 µL schłodzonego 100% etanolu oraz 5 µL mieszaniny GlycoBlue. Dobrze wymieszać i przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.

Dodatkowo, aby zapewnić prawidłowe odzyskanie RNA, dodanie glyco blue zwiększy widoczność osadu RNA, pełniąc rolę cząsteczki nośnika. Następnego dnia wymieszać zawartość probówek, odwracając je trzy do pięciu razy, a następnie wirować przy 12 000 G w temperaturze 4 °C przez 30 minut i odrzucić nadsącz. Do niebieskiego osadu dodać 1 ml schłodzonego 70% etanolu i wymieszać poprzez odwracanie lub wortexowanie, a następnie odwirować.

Wirować próbkę przy 12 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty. Odrzucić supernatant i wirować przy 12 000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć pozostały 70% etanol za pomocą pipety i wysuszyć osad na powietrzu.

Pozostawić w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Rozpuścić ponownie w 20 do 40 µL wody wolnej od RNaz i DNaz. Próbka jest teraz gotowa do ilościowego oznaczenia za pomocą spektrometrii NanoDrop oraz do dalszych zastosowań, takich jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym lub analiza mikromacierzy. Po izolacji RNA przeprowadzono analizę mikromacierzy oraz ilościową PCR w czasie rzeczywistym, aby zidentyfikować cele mRNA białka wiążącego RNA who are oraz stopień ich wzbogacenia w wyniku immunoprecypitacji.

Potwierdzenie za pomocą western blot wykazuje czystą izolację białek. Ilościowy PCR demonstruje krotność wzbogacenia mRNA beta actin w porównaniu z kontrolami IgG. Podczas gdy analiza mikromacierzy ujawnia unikalne profile genetyczne linii komórkowych raka piersi MC seven oraz MB 2 31, immunoprecypitacja rybonukleoprotein została uznana przez naszą grupę, jak i przez wiele innych grup badawczych, za doskonałe narzędzie służące do izolacji i badania oddziaływań między białkami wiążącymi RNA a ich celami mRNA. Pomimo że procedura ta jest z natury i w praktyce wymagająca, jej prawidłowe wykonanie pozwoli na izolację tych kompleksów rybonukleoproteinowych, które do niedawna były niedostępne dla odkryć i analiz.