Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Myszy otrzymują 3% DSS ad libitum przez cztery dni. Podczas gdy codziennie rejestruje się masę ciała oraz występowanie biegunki i krwi w kale, po czwartym dniu DSS zostaje zastąpiony wodą z autoklawu. Po trzech dniach dostępu do wody myszy są uśpiane, a następnie usuwa się ich okrężnice.

Okrężnice są mierzone i ważone. Następnie okrężnice są formowane w postaci zwiniętych rulonów (tzw. swiss rolls) lub kciukowatych wałeczków i badane pod mikroskopem. Niniejszy artykuł wideo zaprezentuje sposób pobierania i przetwarzania okrężnic w mysim modelu zapalenia jelita grubego.

Niniejsza procedura jest stosowana do badania zapalenia jelita grubego w laboratorium dr. Christophera Williamsa z Katedry Biologii Nowotworów na Uniwersytecie Vanderbilt przed rozpoczęciem leczenia dekstranem siarczanem sodu. Wagi wyjściowe są ustalane w trakcie całego eksperymentu. Codzienne pomiary masy ciała są przeprowadzane po zważeniu myszy, a następnie przygotowuje się 3% (w/v) roztwór soli dekstranu siarczanu sodu (DSS) w wodzie.

Aby ten model był skuteczny, DSS musi mieć niską masę cząsteczkową. Przygotuj odpowiednią ilość roztworu DSS, aby napełnić butelkę z wodą dla każdej klatki myszy, a następnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,45 µm. Zastąp butelkę z wodą pitną w klatce myszy butelką zawierającą 3% roztwór DSS. Jeśli w Twojej instytucji stosowany jest automatyczny system pojenia, zamocuj końcówki blokujące na wylewkach, aby upewnić się, że myszy nie mają dostępu do żadnego innego źródła wody.

Po czterech dniach myszy są ponownie ważone, aby określić systemiczne skutki zapalenia jelita grubego. Utrata masy ciała jest częsta przy ciężkich uszkodzeniach, jednak może nie być widoczna przez kilka kolejnych dni. Czwartego dnia roztwór DSS należy zastąpić wodą na kolejne trzy dni, aby umożliwić częściową regenerację nabłonka jelita grubego.

Trzy dni później, w siódmym dniu, ponowno ważymy myszy. Następnie z uśpionych myszy można pobrać okrężnicę, zgodnie z opisem w następnej sekcji. Aby pobrać okrężnicę, należy odsłonić stronę brzuszna uśpionej myszy, aby zapewnić niezakłócony dostęp do jamy brzusznej.

Całkowicie zwilżyć brzuch 70% etanolem. Chwycić linię środkową brzucha pęsetą anatomiczną i unieść ją, napinając skórę, a następnie naciąć ją nożyczkami o cienkich końcówkach.

Nacinamy brzuch, aby odsłonić jego zawartość. Przedłużamy nacięcie w linii środkowej aż do wierzchołka wyrostka mieczykowatego, a następnie wzdłuż dolnej krawędzi łuków żebrowych obustronnie. Identyfikujemy kątnicę jelita cienkiego oraz okrężnicę.

Ostrożnie odseparuj lub rozdziel okrężnicę od otaczającej ją krezki. Następnie przetnij okrężnicę głębiej w miednicy, aby uwolnić końcowy odcinek okrężnicy od odbytnicy.

Należy zachować ostrożność, aby nie przeciąć żadnych tętnic ani żył. Należy również pamiętać, że okrężnica może łatwo ulec przerwaniu. Dlatego należy delikatnie oddzielić okrężnicę od krezki.

Przetnij okrężnicę na marginesie Colona sequel, aby uwolnić jej część bliższą. Usuń okrężnicę, a następnie, używając igły do karmienia 20 G i strzykawki 10 ml, zaintubuj i przepłucz okrężnicę lodowatym PBS, aż EIT będzie całkowicie oczyszczone z treści kałowej. Ważne jest zachowanie prawidłowej orientacji okrężnicy poprzez trzymanie jej końca dalszego najbliżej siebie.

Zacznij od zmierzenia długości jelita grubego za pomocą suwmiarki cyfrowej. Długość jelita grubego jest kolejnym wskaźnikiem stopnia ciężkości uszkodzenia. Zapalenie jelita grubego zwiększa obrzęk i skraca całkowitą długość jelita.

Na tym etapie pobrane okrężnice można przetworzyć w formie „kiełbasek” do analizy makroskopowej lub przygotować tzw. „szwajcarski roladę” (Swiss roll) do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego. W następnych sekcjach zaprezentujemy techniki przetwarzania okrężnicy w formie kiełbasek. W celu przeprowadzenia analizy makroskopowej całej okrężnicy ważne jest zachowanie jej prawidłowej orientacji. Dlatego też należy umieścić koniec dystalny okrężnicy najbliżej siebie.

Odetnij dwa kawałki nici niewchłanialnej, jeden o długości około jednej cala i drugi o długości dwóch cali. Użyj dwucalowego kawałka nici, aby podwiązać dystalny koniec jelita grubego tak blisko krawędzi, jak to możliwe, zapewniając jednocześnie szczelne zamknięcie. Następnie wprowadź igłę do karmienia o rozmiarze 20 G zawierającą pięć mililitrów 10% buforowanej formaliny fosforanowej do proksymalnego końca jelita grubego.

Luźno zawiąż pozostały fragment nici chirurgicznej bezpośrednio proksymalnie względem głowicy igły do wprowadzania cieczy. Następnie mocno chwyć jelito grube w miejscu głowicy igły i wprowadź odpowiednią ilość formaliny, upewniając się, że jelito jest rozszerzone. Zaciśnij węzeł na nici podczas wyciągania igły, pozostawiając w ten sposób nasycone i rozszerzone jelito grube.

Wypełnij 15 mililitrową probówkę stożkową 10% buforem formaldehydowo-fosforanowym i opisz probówkę. Umieść okrężnicę w probówce i utrwalaj przez 24 godziny. Po 24 godzinach odlej formalinę do odpowiedniego pojemnika na odpady i zastąp ją 70% etanolem na kolejne 24 godziny.

Jejunia mogą być przechowywane w 70% etanolu w temperaturze pokojowej przez nieokreślony czas. Przed przystąpieniem do analizy jelita grubego należy wyjąć je z probówki stożkowej. Przeciąć sznurki na obu końcach skalpelem, uważając, aby nie uszkodzić jelita.

Należy pamiętać, że koniec dystalny ma najdłuższy odcinek sznurka. Przetnij okrężnicę wzdłużnie od końca dystalnego do proksymalnego, tak aby utworzyła długi płat. Okrężnicę można teraz oglądać pod mikroskopem stereoskopowym.

Przetnij okrężnicę wzdłużnie i rozłóż ją na płaskiej powierzchni. Zwijanie okrężnicy wymaga użycia dwóch par pincet i techniki dwuręcznej. Chwyć obie krawędzie boczne dystalnego brzegu okrężnicy pincetami, a następnie sukcesywnie zwijaj okrężnicę poprzez rotację i puszczanie pincet, kierując się w stronę brzegu proksymalnego, tworząc w ten sposób spiralę trójwymiarową, tzw. swiss roll.

Jeśli jelito grube przylega do papieru Watmana, zwilż papier i jelito niewielką ilością PBS, aby zachować jego kształt. Mocno chwyć zwinięty fragment pęsetą i przetnij go igłą o rozmiarze 27,5 G. Zabeziecz zwinięty fragment, zginając igłę w miejscu, w którym opuszcza ona tkankę.

Następnie umieść zwitek w opisowanej kasecie do tkanek, a kasetę w słoiku z 10% buforowanym formalinem fosforanowym. Pozostaw go w temperaturze pokojowej przez 24 godziny w celu utrwalenia tkanki. Po 24 godzinach zlej formalin i zastąp go 70% etanolem na kolejne cztery godziny.

Jejunia mogą być przechowywane w 70% etanolu w temperaturze pokojowej bez ograniczeń czasowych. Model ten pozwala badaczowi na pobranie, utrwalenie i analizę jelit grubych, co umożliwia ocenę stopnia nasilenia zapalenia jelita grubego. W celu analizy makroskopowej całego jelita grubego można je przetworzyć w formie „kiełbasy”, która jest nasycana formaliną i całkowicie rozprostowana.

Otwarta „kiełbaska” powinna leżeć płasko. Jeśli metoda „kiełbaski” została wykonana prawidłowo, utrwalone jelito grube będzie rozszerzone, a cała powierzchnia śluzówki będzie łatwo dostępna do manipulacji i obserwacji pod mikroskopem stereoskopowym. Do analizy histologicznej jelito grube można przetworzyć metodą „swiss roll”.

Zwinięty fragment jest zabezpieczony igłą i umieszczony w kasecie tkankowej w celu utrwalenia. Po przecięciu i zamontowaniu, przy prawidłowym zwinięciu, powinien on tworzyć reprezentatywny przekrój całego okrężnika; sekcje tzw. szwajcarskiego rulonu (Swiss roll) można barwić hematyną i ASIN w celu określenia zakresu uszkodzeń okrężnicy. Należy pamiętać, że koniec dystalny okrężnicy znajduje się w centrum rulonu na preparacie.

W tym przykładzie w jelicie grubym traktowanym DSS widoczne są stan zapalny i uszkodzenia krypt w porównaniu z kontrolą traktowaną wodą. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak pobierać i przetwarzać jelita grube z mysiego modelu ostrego zapalenia jelit. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby być dobrze zorganizowanym przed uśmierceniem zwierząt.

W przypadku myszy wszystkie probówki i kasety dla każdego osobnika powinny być odpowiednio oznakowane, a wszystkie narzędzia i odczynniki muszą być łatwo dostępne. Ponadto należy prowadzić szczegółowe zapisy masy ciała myszy oraz długości jelita grubego. Na koniec upewnij się, że przeznaczyłeś wystarczająco dużo czasu na procesowanie próbek.

Zazwyczaj zajmuje to 15 minut na jedną mysz w przypadku osoby początkującej oraz od sześciu do ośmiu minut w przypadku osoby bardziej doświadczonej w tej technice.