Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

W dniu zerowym myszy wstrzyknięto azoksymetanu lub OM w następnym tygodniu. Ich wodę pitną zastąpiono roztworem zawierającym siarczan dekstranu sodu lub DSS. W trzecim tygodniu myszy otrzymywały wodę przez kolejne dwa tygodnie.

Ten cykl podawania DSS w wodzie jest powtarzany jeszcze dwukrotnie. Po drugim cyklu DSS myszy można zbadać pod kątem obecności guzów za pomocą endoskopii lustrzanej.

Po 10. tygodniu myszy są uśpione, a ich okrężnice pobierane. Okrężnice są płukane i rozcinane wzdłużnie. Następnie ocenia się wielkość oraz liczbę guzów w obrębie okrężnic.

Przekrój podłużny okrężnicy, podzielony na trzy części, można zalać w parafinie i przekazać do analizy histologicznej. Za pomocą mikroskopii świetlnej można policzyć i sklasyfikować guzy. Prezentujemy protokół, w którym podaje się genotoksyczny czynnik OM, a następnie trzy cykle czynnika prozapalnego.

DSS szybko i konsekwentnie wywołuje guzy jelita grubego u myszy, wykazujące podobieństwa morfologiczne i molekularne do tych obserwowanych w przebiegu raka jelita grubego związanego z zapaleniem colitis u ludzi. W dniu zerowym należy indywidualnie oznaczyć myszy za pomocą znaczników ogonowych lub wycięć usznych, zapisać masę początkową każdej myszy w tabeli, a następnie wstrzyknąć każdej myszy roztwór OM w dawce 10 mg/kg. Należy zachować ostrożność podczas pracy z OM, ponieważ jest to czynnik genotoksyczny. W siódmym dniu myszy otrzymują 2,5% roztwór DSS w wodzie pitnej przez następny tydzień. Aby przygotować ten roztwór, należy dodać proszek DSS do wody destylowanej i mieszać do momentu rozpuszczenia.

Roztwór jest gotowy po przepuszczeniu go przez filtr z octanu celulozy o porach 0,2 mikrona. Aby zapewnić ciągłe dostarczanie roztworu DSS przez siedem dni, należy wymieniać DSS co dwa do trzech dni.

Po tym okresie przenieść myszy z powrotem do klatek z wodą na dwa tygodnie. Ważyć myszy dwa do trzech razy w tygodniu i obserwować pod kątem krwawienia z odbytu oraz biegunki. U myszy z dużymi guzami może tymczasowo wystąpić wypadanie odbytu, choć zazwyczaj nie obniża to odsetka przeżywalności.

Utratę masy ciała w stosunku do wartości bazowej wykorzystuje się jako miarę zastępczą stopnia ciężkości zapalenia jelita grubego. W tygodniu następującym po pełnym cyklu podawania DSS można spodziewać się utraty masy ciała do 10% wraz z dwu- lub trzydniową biegunką i krwawieniem z odbytu. W celu potwierdzenia wzrostu guza in vivo przed uśmierceniem zwierząt można przeprowadzić drugi lub trzeci cykl podawania DSS.

Ponieważ model A-O-M-D-S-S jest bardzo wiarygodny w indukowaniu nowotworów, ten etap jest zazwyczaj zbędny. Tą metodą należy ocenić tylko kilka myszy, ponieważ może ona doprowadzić do uszkodzenia guzów. Stanowisko pracy powinno zawierać zlewkę ze sterylnym roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS) oraz pustą zlewkę.

Aby usunąć zużyty PBS, nabierz od 8 do 10 ml PBS do strzykawki i podłącz ją do endoskopu przed każdym użyciem. W celu wypłukania treści wewnątrzświatowej znieczul każdą mysz za pomocą sedacji wziewnej lub wstrzykiwanej i przymocuj zwierzę do płaskiej deski taśmą w obrębie ogona i klatki piersiowej; można również unieruchomić poduszki łap myszy. Aby upewnić się, że sedacja jest wystarczająca, użyj kciuka i palca wskazującego, aby ucisnąć dolną część brzucha myszy w celu odsłonięcia odbytu, a następnie wprowadź endoskop Muren do odbytnicy myszy.

Delikatnie użyć PBS do nadmuchania i przemycia, aby poprawić widoczność wewnątrz światła jelita i usunąć zawartość kałową. Kontynuować powolne wprowadzanie endoskopu, obserwując monitor. W przypadku obecności dużych guzów w 70. dniu każda mysz leczona A-O-M-D-S-S powinna wykazywać liczne guzy okalnicze i być gotowa do oceny.

Ten etap można opóźnić o tygodnie lub miesiące, jeśli pożądane są większe guzy. Przygotować strzykawkę wypełnioną PBS z przymocowaną igłą do zgłębnikowania. Strzykawka z 10% formaliną, podstawowe nożyczki chirurgiczne, nożyczki z zaokrąglonymi końcówkami.

Mała strzykawka wypełniona 1% roztworem błękitu Evansa oraz precyzyjna pęseta. Należy również przygotować chłodną tacę, naczynko z schłodzonym PBSA, nową żyletkę do sekcjonowania oraz naczynie do fiksacji wypełnione 10% formaliną. Każdą mysz należy poddać eutanazji za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjnego lub innej zatwierdzonej przez instytucję metody. Można dokonać pomiaru masy końcowej oraz innych pomiarów.

W tym momencie ułóż mysz na desce sekcyjnej brzuchem do góry. Spryskaj brzuch 70%etanolem, aby usunąć włosy z obszaru sekcji. Za pomocą pęsety uchwyć linię środkową brzucha i wykonaj niewielkie nacięcie skóry, aby odsłonić otrzewną.

Zastosuj delikatną trakcję, aby oddzielić skórę od otrzewnej i odsłonić całą jamę brzuszną. Wykonaj nacięcie otrzewnej i przedłuż je wzdłuż łuków żebrowych po obu stronach. Używając zamkniętych nożyczek, odsuń jelito cienkie i grubą jelitę na bok.

Umożliwi to odsłonięcie węzłów chłonnych krezkowych, które można opcjonalnie pobrać. W celu oceny należy odsunąć układ moczowo-płciowy w dół, aby odsłonić zstępnicę oraz odbytnicę, a następnie wyciąć pęcherz moczowy i organy rozrodcze w stopniu niezbędnym do dalszego odsłonięcia miednicy, uważając, aby nie uszkodzić sąsiednich tkanek.

Przetnij dolną i górną gałąź kości łonowej, aby odsłonić miejsce połączenia odbytnicy z kanałem odbytowym. Przetnij skórę wokół połączenia odbytnicy z kanałem odbytowym, aby uwolnić okrężnicę, wywierając jednocześnie delikatny nacisk w kierunku górnym. Za pomocą kleszczyków naczyniowych (mesenteric) można wyciąć lub odsunąć przyczepy okrężnicy.

Ważne jest, aby zachować fragment skóry w miejscu połączenia odbytu z odbytnicą, ponieważ obszar ten jest często dotknięty dysplazją. Przetnij jelito grube od jelita cienkiego bezpośrednio proksymalnie w stosunku do kątnicy. Oddziel kątnicę od przyległego okaltnika, używając igły do gavage o rozmiarze 18 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 5 ml.

Przepłucz okrężnicę lodowatym PBS w taki sposób, aby płyn wypływał w kierunku fizjologicznym, używając nożyczek z zaokrąglonymi końcami. Rozetnij okrężnicę wzdłuż krezówki. Rozprostuj otwartą okrężnicę na zimnej tacy.

Upewnij się, że tacka została wystarczająco rozmrożona, aby nie zamrozić tkanki. Nanieś palcem kilka kropel 1% Ian Blue w celu lepszej wizualizacji guzów. Oceń liczbę i rozmiar guzów za pomocą linijki lub wykonaj zdjęcia do analizy cyfrowej.

Na tym etapie można wyciąć niewielkie fragmenty guza wraz z przyległą prawidłową tkanką do późniejszej analizy metodami białkowymi RNA lub immunohistochemicznymi, pozostawiając część okrężnicy do oceny histologicznej. Należy nanieść 10% formalinę na pozostałą część okrężnicy na tacy chłodzącej za pomocą strzykawki lub palca, pozwalając tkance na utrwalenie przez co najmniej 30 sekund. W ten sposób ułatwia się przeniesienie preparatu do naczynia z utrwalaczem.

Przed malowaniem nowej, otwartej okładziny jelita grubego na tej samej tacy należy upewnić się, że resztki formaliny zostały wytarte. Przenieś okładzinę do kuwety wypełnionej 10% formaliną i przypnij jej brzegi. Po trzech godzinach utrwalania wylej formalinę i zastąp ją 70% etanolem.

Jejuny można przechowywać w 70% etanolu w nieskończoność. W niskiej temperaturze należy przygotować 2% roztwór agaru, a następnie odłożyć czysty szkiełko na szklaną płytkę. Utrwalony odcinek jelita grubego należy przeciąć na trzy części, a nieużyte fragmenty zwrócić do naczynia z etanolem.

Przytnij fragmenty do jednolitej wielkości, używając dwóch żyletki. Osadź przekroje i warstwy jelita grubego w agarze na czystym szkiełku. Powtórz ten proces dla kolejnego fragmentu jelita grubego.

Wyciąć fragment, usunąć nadmiar agaru i umieścić zatopioną okolicę jelita grubego w kasecie w celu przetworzenia i barwienia hematoksyliną i eozyną. Rysunek 1 przedstawia protokół indukcji raka związanego z zapaleniem jelit. Rysunek 2 przedstawia masę ciała myszy w stosunku do wartości wyjściowej podczas podawania OM i DSS.

Należy zauważyć, że w tygodniu następującym po każdym cyklu DSS myszy tracą od 5% do 10% masy ciała. Utrata masy ciała w tym eksperymencie jest markerem zastępczym dla stopnia ciężkości zapalenia jelita grubego. Rysunek 3 przedstawia widok guzów w dalszej części jelita grubego podczas endoskopii muren w 50. dniu leczenia A-O-M-D-S-S.

Należy zwrócić uwagę na liczne masy polipowate zamykające światło okrężnicy dystalnej na panelach B i C w porównaniu z normalną okrężnicą. Panel a na rysunku cztery przedstawia podłużnie rozciętą okrężnicę myszy, ilustrując makroskopowy wygląd guzów. Zauważalne jest większe obciążenie nowotworowe w okrężnicy dystalnej oraz charakterystyczna tekstura okrężnicy proksymalnej z niewielkim wzrostem guza.

Rysunek pięć przedstawia guzy wyróżnione poprzez zastosowanie barwnika lc and blue. Zauważmy, w jaki sposób barwnik podkreśla naturalną strukturę jelita grubego, a także granice każdego poszczególnego guza. Takie barwienie może być pomocne przy precyzyjnym pomiarze obszarów guzów za pomocą linijki lub pomiaru cyfrowego.

Rysunek sześć przedstawia reprezentatywny rozkład średniej liczby guzów na mysz traktowaną OM i DSS. Należy zauważyć, że większość guzów znajduje się w końcowej części okrężnicy i ma rozmiar mniejszy niż dwa milimetry. Rysunek siedem przedstawia zatopione w parafinie przekroje podłużne okrężnicy w kasecie oraz preparat barwiony H i E.

Należy zauważyć, że resztki barwnika S oraz barwienia niebieskiego nie kolidują z barwieniem H&E. Na obrazie preparatu zaznaczono okręgiem duży guz. Oznaczenia dystalny, środkowy i proksymalny wynikają z podzielenia całego okrężnicy na trzy części między kątnicą a odbytem.

Rysunek osiem przedstawia reprezentatywną histologię guza powstałego w wyniku podania OM i DSS w końcowym odcinku okrężnicy. Przedstawione mikrofotografie są barwione H i E-B-R-D-U oraz beta-kateniną i wykazują zmiany dysplastyczne podobne do ludzkich gruczolaków okrężnicy. W tym filmie zaprezentowaliśmy protokół indukowania stanu zapalnego prowadzącego do nowotworzenia w okrężnicy myszy, z wykorzystaniem pojedynczego wstrzyknięcia OM, po którym następowały trzy siedmiodniowe cykle podawania DSS.

W okresie 10 tygodni model ten indukuje guzy z cechami histologicznymi i molekularnymi ściśle przypominającymi zmiany występujące w przebiegu raka jelita grubego powiązanego z zapaleniem colitis u ludzi, stanowiąc niezwykle cenny model do badania onkogenezy oraz chemoprewencji w tej chorobie.