Badanie presynaptycznie cichych synaps z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej
4 stycznia 2010
Synapsy glutaminergiczne mogą przełączać się z trybu aktywnego w tryb cichy. Wykazujemy, że status aktywności presynaptycznej w dysocjowanej kulturze neuronów gryzoni można zwizualizować, wykorzystując utrwalalną formę barwnika FM1-43 do obrazowania synaps aktywnych oraz immunobarwienie przeciwciałami przeciwko vGluT-1 w celu wizualizacji wszystkich synaps glutaminergicznych.
Niektóre terminale presynaptyczne w ośrodkowym układzie nerwowym wydają się niefunkcjonalne lub ciche. Przedstawiamy tutaj protokół identyfikacji cichych terminali presynaptycznych. Protokół ten można zastosować do identyfikacji metod leczenia i manipulacji, które w podejrzeniu prowadzą do wyciszenia lub aktywacji terminali.
Protokół ten łączy znakowanie pęcherzyków synaptycznych barwnikiem witalnym podczas depolaryzacji neuronów z późniejszym znakowaniem utrwalonych komórek przeciwciałem, które wybarwia wszystkie terminale presynaptyczne, zarówno ciche, jak i aktywne. Synapsy oznakowane jednocześnie barwnikiem i przeciwciałem są aktywne. Synapsy oznakowane wyłącznie przeciwciałem są ciche.
Witajcie, nazywam się Amanda Taylor i pochodzę z laboratorium dr. Steve'a Minicka z Katedry Psychiatrii w Washington University School of Medicine. Jestem również Shahin z laboratorium Manica. Dzisiaj chcielibyśmy zaprezentować Państwu procedurę wizualizacji cichych terminali presynaptycznych z wykorzystaniem hodowli neuronów hipokampa.
Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby zbadać, w jaki sposób aktywność elektryczna oraz inne szlaki sygnalizacji pojedynczej modulują uwalnianie neurotransmiterów. Przejdźmy zatem do pracy. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza użyj HIPA, aby pobrać materiał od szczurów lub myszy w wieku od 0 do 3 dni po urodzeniu w celu przygotowania dysocjowanych kultur komórkowych.
Zgodnie z naszym opublikowanym protokołem, nasze hodowle to mieszane hodowle glejowe pochodzące z tej samej dyssekcji; komórki należy wysiać w sterylnych szalkach 35 mm. Każda z nich powinna zawierać szkiełko przedmiotowe numer zero, pokryte kolagenem w stężeniu 5 mg/mL. Neurony wysiewamy z przybliżoną gęstością 500 komórek/cm².
12 szczeniąt szczura zazwyczaj pozwala na przygotowanie 30 szalek o średnicy 35 milimetrów. Pozostaw kultury do wzrostu w inkubatorze przez 10 do 14 dni. W celu rozwoju i dojrzewania synaps, w czwartym dniu in vitro dodaj środek antymitotyczny a C, aby zahamować wzrost gleju.
Również w piątym dniu in vitro należy przeprowadzić połowiczną wymianę pożywki na pożywkę neurobasal z dodatkiem suplementu B 27, aby zwiększyć przeżywalność neuronów w tym okresie dojrzewania. Należy wprowadzić zabiegi zmieniające liczbę presynaptycznie cichych synaps. Stwierdzono, że wygodnym sposobem na wyciszenie dużego odsetka synaps glutaminianergicznych jest czterogodzinna inkubacja z 30 mM potasu.
Gdy kultury dojrzeją, neurony powinny mieć stosunkowo niską gęstość z dobrze odseparowanymi i rozbudowanymi wypustkami neuronalnymi. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś je na blat laboratoryjny. Zastąp pożywkę hodowlaną buforowanym roztworem soli fizjologicznej zawierającym 45 millimolar potassium chloride oraz 10 micromolar barwnika FM 1 43 FX.
Roztwór ten powinien zawierać również NBQX oraz APV, aby zapobiec sygnalizacji powrotnej. Ważne jest, aby roztwór zapasowy FM 1 43 FX oraz prowadzone eksperymenty były przechowywane w ciemności, aby zapobiec fotobleachingowi. Dlatego należy przykryć naczynia hodowlane folią podczas wszystkich kolejnych etapów inkubacji.
Inkubować dokładnie przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór barwnika i płukać przez zaledwie trzy do pięciu sekund w buforze fosforanowym (PBS) z 500 µM azotu. W celu usunięcia nieswoistego wiązania barwnika, precyzyjny czas trwania tego etapu jest krytyczny.
Ponieważ przedłużona ekspozycja na adv adverse F seven spowoduje usunięcie całego znakowania FM 43 FX, należy następnie przemyć komórki w roztworze fosforanu soli buforowanej (PBS) bez adv adverse Seven w pięciu dwuminutowych odstępach czasu w dygestorium chemicznym.
Utrwalić hodowle w 4%paraldehydzie i 0,2%glutaraldehydzie w PBS przez 10 minut. Krótko przemyć komórki PBS. Komórki można teraz wyjąć z dygestorium.
Dodaj roztwór blokujący zawierający 4% normalnego surowicy koziej oraz 0,04% Triton X, aby zredukować tło i zwiększyć przepuszczalność komórek dla barwienia immunologicznego. Inkubuj przez 15 minut. Obarw komórki przeciwciałem vlu T one rozcieńczonym w roztworze blokującym w stosunku 1:2000.
Inkubować hodowle w przeciwciałach przy delikatnym kołysaniu przez trzy godziny. Przemyć komórki czterokrotnie PBS. Inkubować komórki z Alexa.
Przeciwciało anty-świnka morska sprzężone z 6 47 rozcieńczone 1:500 w roztworze blokującym. Hodowle inkubować z przeciwciałem wtórnym przez 30 minut przy delikatnym kołysaniu. Komórki przemyć jeszcze cztery razy buforem PBS.
Za pomocą pęsety nanieś małą kroplę zawiesiny komórek na czyste szkiełko przedmiotowe. Podnieś szkiełko nakrywkowe i ostrożnie opuść je na kroplę, tak aby komórki przylegały do szkiełka przedmiotowego. Pozostaw preparat do wyschnięcia na noc.
Przygotuj obiektyw immersyjny 60x z olejem w konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym. Umieść preparat na stoliku tak, aby szkiełko zakryciowe było skierowane w stronę obiektywu. Znajdź pole z neurytami, które nie jest zbyt gęste i znajduje się z dala od somy, w której może zalegać resztkowy barwnik.
Ustaw powiększenie tak, aby pole widzenia wynosiło 51 by 51 mikronów. Korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, wykonaj stos ZS obejmujący głębokość 7.8 mikronów w 27 krokach o wielkości 0.3 mikronów na każdy krok.
Najpierw wykonaj skanowanie pod kątem przeciwciała VLU T one, aby zidentyfikować wszystkie synapsy glutaminergiczne w polu widzenia. Następnie ponownie przeskanuj próbkę pod kątem fluorescencji FM 1 43 FX, aby przeanalizować obrazy po akwizycji. Użyj oprogramowania analitycznego, aby przekształcić stos Z w kompozytowy obraz jednej płaszczyzny na podstawie maksymalnego odczytu intensywności z dowolnej płaszczyzny dla każdego piksela, ustawiając próg.
Aby zmniejszyć tło, zidentyfikuj terminale VG glu T one bez odniesienia do barwienia FM 1 43. Następnie oznacz te punkta jako obszary zainteresowania. Zazwyczaj wybieramy 10 PUNTA na pole widzenia.
Powtórz proces progowania i wyboru punktów (puncta) na obrazie efektów FM 1 43, a następnie nałóż obrazy na siebie w celu zidentyfikowania synaps cichych. Aby odróżnić aktywne synapsy FM 1 43-dodatnie od nieaktywnych FM 1 43-ujemnych, można zastosować bezwzględne kryterium pikseli lub kryterium procentowe. W naszych kulturach stwierdzono, że 70 do 80% synaps glutaminianergicznych zdefiniowanych przez barwienie V glut one wykazuje wykrywalne barwienie FM 1 43 na nałożonych obrazach zielonej fluorescencji FM 1 43 i czerwonego barwienia V glut one.
Jest to widoczne jako obfitość żółtych punktów synaptycznych z kolokalizacją markerów. Są one wskazane strzałkami. Około 20 do 30% czerwonych punktów dodatnich dla Vglut1 nie wykazuje zielonej fluorescencji FM 1-43 powyżej poziomu bazowego.
Są to nieaktywne terminale presynaptyczne, a przykład jednego z nich wskazano grotem strzałki. Zaobserwowana zostanie również trzecia populacja synaps. Wykazują one pozytywną zieloną fluorescencję FM 1 43, lecz są pozbawione czerwonego barwienia B glut one.
Są to aktywne synapsy GABAergiczne, a przykład jednej z nich zaznaczono gwiazdką. Są one wykluczone z większości naszych analiz, lecz można je badać bezpośrednio, stosując przeciwciało przeciwko pęcherzykowemu transporterowi GABA. Zamiast przeciwciała przeciwko VGLUT1, pokazaliśmy właśnie, jak wizualizować presynaptycznie ciche synapsy, wykorzystując barwienie FM 1-43 oraz immunobarwienie VGLUT1.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że FM 1 43 FX jest wrażliwy zarówno na czas przebywania w roztworze piorącym adver sub seven, jak i na stężenie środka traktującego X 100 zawartego w roztworze blokującym. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół identyfikacji cichych zakończeń presynaptycznych w ośrodkowym układzie nerwowym. Dzięki połączeniu znakowania barwnikami witalnymi z immunobarwieniem badacze mogą rozróżnić synapsy aktywne od cichych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Funkcja synaptyczna
Wstęp
- Niektóre zakończenia presynaptyczne są niefunkcjonalne lub ciche.
- Zrozumienie aktywności synaptycznej jest kluczowe dla badań z zakresu neuronauki.
- Identyfikacja cichych zakończeń może pomóc w badaniu różnych metod leczenia.
- Wizualizacja aktywności synaptycznej może dostarczyć informacji na temat komunikacji neuronalnej.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody identyfikacji niemych zakończeń presynaptycznych.
- Zbadanie wpływu różnych zabiegów na aktywność synaptyczną.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki synaptycznej w sieciach neuronalnych.
Zastosowane metody
- Znakowanie pęcherzyków synaptycznych barwnikiem witalnym podczas depolaryzacji neuronów.
- Immunobarwienie przeciwciałem znakującym wszystkie terminale presynaptyczne.
- Techniki podwójnego znakowania w celu rozróżnienia synaps aktywnych i cichych.
- Wykorzystanie barwnika FM1-43 do wizualizacji aktywnych synaps.
Główne wyniki
- Aktywne synapsy można zwizualizować za pomocą barwnika FM1-43.
- Immunobarwienie ujawnia wszystkie terminale presynaptyczne, w tym te nieme.
- Protokół skutecznie rozróżnia synapsy aktywne od niemych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia plastyczności i funkcji synaptycznej.
Wnioski
- Opracowany protokół jest cennym narzędziem w badaniach nad neuronauką.
- Identyfikacja terminali cichych może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie zachowania synaptycznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Identyfikacja synaps nieaktywnych presynaptycznie umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów terapeutycznych poprzez ujawnienie heterogeniczności funkcjonalnej sieci neuronalnych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w testach przesiewowych, odróżniając aktywne od nieaktywnych miejsc uwalniania glutaminianu. Pomaga ona w selekcji projektów badawczych poprzez powiązanie mechanizmów plastyczności synaptycznej z systemami istotnymi dla danej choroby w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ilościowe określanie stanów wyciszenia lub aktywacji presynaptycznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki bezpośredniej wizualizacji zdolności do uwalniania pęcherzyków.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez korelację sygnałów cAMP lub wyciszenia elektrycznego z efektami funkcjonalnymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do oceny związków, wykorzystując kolokalizację sygnałów FM1-43 FX i vGluT-1.
- Wynik ilościowy: Umożliwia standaryzowany pomiar procentu aktywnych synaps za pomocą analizy obrazu opartej na progu odcięcia.
- Powtarzalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dzięki standaryzowanym protokołom fiksacji, barwienia i obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Łączy plastyczność presynaptyczną ze ścieżkami uczenia się i pamięci zależnymi od hipokampa.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez monitorowanie adaptacji synaptycznej do stosowanych terapii.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez kwantyfikację populacji synaps cichych w warunkach bazowych i modulowanych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając funkcjonalny odczyt aktywności zakończeń presynaptycznych przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zabiegów zmieniających wyciszenie presynaptyczne poprzez depolaryzację potasową lub aktywację cAMP.
- Przesiewanie: Zapewnia gotową do analizy, powtarzalną kwantyfikację zdolności do uwalniania glutaminianu w dysocjowanych kulturach hipokampa.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (np. % punktów FM1-43+/vGluT-1+), umożliwiając porównanie poszczególnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie adaptacji synaptycznej istotnej dla mechanizmów zaburzeń neuropsychiatrycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną możliwość przesiewania modulatorów funkcji presynaptycznych w różnych modelach neuronalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez bezpośrednią ocenę prawdopodobieństwa uwalniania pęcherzyków.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki protokołowi obrazowania utrwalonych komórek i współbarwienia.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki zmniejszeniu niejednoznaczności mechanistycznej w odniesieniu do efektów działania leków synaptycznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o dane dotyczące funkcjonalnej modulacji synaptycznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli neuronów, mikroskopii konfokalnej oraz analizie obrazów fluorescencyjnych.
- Wymagane jest instrumentarium obejmujące skaningowy mikroskop laserowy z obiektywem olejowym 60x i możliwością akwizycji stosu Z (Z-stack).
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie czasu barwienia, stężenia barwnika i rygorystyczności przemywania.
- Wymaga rozważenia adaptacji metody dla neuronów pozahippokampalnych lub alternatywnych transporterów pęcherzykowych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak wrażliwość FM1-43 FX na czas przemywania kwasem askorbinowym oraz skład roztworu blokującego.
