Wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Urządzenie do insertów hipoksycznych posiada sześć filarów, które mieszczą się w dołkach płytki sześciodołkowej. Gaz przepływa przez sieć mikrofluidyczną u podstawy filara i może dyfundować przez gazoprzepuszczalną membranę PDMS, która oddziela sieć gazową od pożywki hodowlanej. Urządzenie to minimalizuje długość drogi dyfuzji między źródłem tlenu, siecią mikrofluidyczną u podstawy filara a komórkami, co pozwala na szybsze wyrównanie stężenia tlenu.

Urządzenie to umożliwia również znacznie większą kontrolę nad przestrzennym rozkładem tlenu dostarczanego do komórek, który jest określany przez konstrukcję mikrofluidycznej sieci gazowej wykonaną metodą standardowej fotolitografii z użyciem masek fotograficznych. Cześć, jestem Sean Ard z laboratorium dr. Davida Edingtona w Katedrze Bioinżynierii na Uniwersytecie Illinois w Chicago. Cześć, jestem Ellie, również z laboratorium Edingtona.

Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykonać, zwalidować i wykorzystać niestandardowe urządzenie do eksponowania hodowli komórkowych in vitro w płytce sześciodołkowej na różne stężenia tlenu. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania wpływu tlenu na gojenie ran, generowanie reaktywnych form tlenu oraz migrację. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Aby rozpocząć wykonanie wkładki natleniającej, należy przygotować polidimetylosiloksan (PDMS), mieszając prepolimer z utwardzaczem w stosunku 10:1. Zgodnie z instrukcjami producenta, mieszaninę PDMS dodaje się do wcześniej obrobionej formy z Delranu, której wzór naśladuje kształt standardowej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami. Po utwardzeniu w temperaturze 75 °C przez noc, otrzymana odlewiona matryca filarów będzie stanowić pierwszy z trzech komponentów tworzących wkładkę natleniającą, co pozwoli na wykonanie drugiego kluczowego elementu wkładki natleniającej.

Matrycę SU-8 przygotowuje się najpierw poprzez nanoszenie SU 8 21 50 metodą spin-coatingu. Na wafelek krzemowy nakłada się maskę fotolitograficzną, a następnie naświetla SU-8 promieniami UV przez maskę, aby stworzyć matrycę z mikrokanałami o grubości 300 µm. Na wierzch matrycy SU-8 wlewa się PDMS i utwardza przez dwie godziny w temperaturze 75 °C, aby uzyskać formę pozytywową, która ostatecznie stworzy mikrokanały u podstawy każdego filarka.

Trzeci komponent urządzenia jest wytwarzany poprzez nanoszenie PDMS metodą wirowania na płytce krzemowej z prędkością 500 RPM przez 10 sekund, a następnie z prędkością 900 RPM przez 30 sekund, aby uzyskać membranę o grubości 100 µm. Ponieważ PDMS jest przepuszczalny dla gazów, tlen może być dostarczany do mikrokanałów bezpośrednio przez tę membranę. Po przygotowaniu wszystkich komponentów każda powierzchnia wiązania jest poddawana działaniu plazmy tlenowej przez jedną minutę.

Używając ręcznego urządzenia plazmowego, najpierw połącz sześć komponentów mikrokanałowych z macierzą filarów, a następnie wykonaj dwa otwory w każdym filarze, które będą służyć jako wloty i wyloty gazu. Na koniec przymocuj membranę do dna mikrokanału, aby ułatwić łączenie i usunąć pęcherzyki powietrza. Powierzchnie potraktowane plazmą dociska się do siebie przez około minutę za pomocą tępego końca pęsety; należy odczekać godzinę pomiędzy kolejnymi etapami łączenia, aby upewnić się, że urządzenie jest całkowicie scalone i może zostać skalibrowane.

Po wykonaniu kompletnego urządzenia należy skalibrować poziom tlenu docierającego do komórek podczas stosowania wkładki natleniającej w rzeczywistych eksperymentach. Do kalibracji należy użyć fluorescencyjnego czujnika tlenu lub płytki foxy, która posiada powłokę z fluorescencyjnego barwnika rutenowego, ulegającego gaszeniu przez tlen. Płytki foxy są docięte tak, aby pasowały do dna płytki 6-dołkowej.

Szkiełko obiektowe należy dociąć tak, aby pokryło jak największą powierzchnię dołka. Ponieważ szkiełko obiektowe ma grubość około 1 mm, należy zmodyfikować urządzenie, aby zachować pożądaną odległość dla odpowiedniej dyfuzji przez membranę.

Odległość ta zależy od eksperymentu, jednak w większości przypadków powinna wynosić poniżej 1 mm. Używając ręcznego urządzenia plazmowego, wytnij cztery szklane podstawki do preparatów o grubości 1 mm, długości około 6 mm i szerokości 4 mm, a następnie przymocuj je do spodu urządzenia. Urządzenie będzie spoczywać na podstawkach umieszczonych na szkiełku przedmiotowym.

Do walidacji zużycia tlenu można również zastosować szklane lamellerki, aby uzyskać szczelinę dyfuzyjną o szerokości 0.17 millimeters. Do otworów płytki 6-dołkowej, w których mierzony będzie tlen, należy wlać trzy milliliters wody dejonizowanej w temperaturze pokojowej. Umieść urządzenie w płytce, a następnie w oprogramowaniu Metamorph wybierz liczbę i położenie pożądanych pozycji na czujniku Foxy.

Przesuń slajd, aby przeprowadzić analizę stężenia tlenu. Połącz rurki pistoletu tai pomiędzy butlą z tlenem a urządzeniem z wkładką hipoksyczną. Do precyzyjnej kontroli podawanego gazu stosuje się precyzyjny regulator przepływu ustawiony na wartość od 50 do 100 ml/min.

Należy upewnić się, że precyzyjny regulator przepływu jest zamknięty. Najpierw otwórz regulator górny zbiornika, a następnie regulator precyzyjny. Po 15 minutach zmniejsz natężenie przepływu do poziomu od 10 do 20 na minutę.

Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza w wodzie, należy uważnie monitorować wartość natężenia przepływu przez następną godzinę i wprowadzać niezbędne korekty, ponieważ spadek ciśnienia ulegnie zmianie podczas równoważenia systemu, co zmieni natężenie przepływu podczas obrazowania płytki i czujników foxy. Do obrazowania wykorzystuje się mikroskop Olympus IX 71 wyposażony w moduł fluorescencyjny, kamerę CCD firmy Q Imaging Tiga oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu SRV i Metamorpho. Mikroskop jest wyposażony w filtr fluorescencyjny Olympus 3 1 0 2 0, kompatybilny z foxy, o długości fali wzbudzenia 475 nanometrów i długości fali emisji 600 nanometrów.

Aby sprawdzić czas wyrównania i stopień natlenienia w urządzeniu, należy wybrać trzy punkty na szkiełku foxy, w których zmierzona zostanie koncentracja tlenu. Należy wykonać zdjęcie szkiełka bezpośrednio przed rozpoczęciem przepływu gazu. Następnie należy wykonywać zdjęcia w odstępach 10 sekund przez 30 minut podczas przepływu gazu przez urządzenie, aby przetestować heterogeniczność oraz dostarczanie tlenu.

Wyznacz wiele punktów w odstępach jednego milimetra w poprzek szerokości kanału i zmierz stężenie tlenu na powierzchni otworu za pomocą oprogramowania Metamorph. Eksportuj średnią intensywność obrazu dla każdej pozycji i przedstaw zależność stężenia natlenienia od intensywności fluorescencji. Wygeneruj krzywą kalibracyjną poprzez dopasowanie linii liniowych do zakresu od 0 do 10% oraz od 10 do 21%, odnosząc intensywność fluorescencji do stężenia tlenu. Dla każdej zmierzonej pozycji surowe dane dotyczące intensywności mogą zostać wyeksportowane z programu Metamorph i poddane dalszej analizie w programie Microsoft Excel lub innym oprogramowaniu statystycznym.

Po skalibrowaniu urządzenia można przystąpić do eksperymentów, takich jak testy gojenia ran; należy wysterylizować skalibrowaną wkładkę w autoklawie w temperaturze 121°C przez 15 minut w ciągu 24 godzin przed eksperymentem i pracować z nią w laminarnym dygestorium do kultur komórkowych, aby zapobiec późniejszemu zanieczyszczeniu. Namoczyć wysterylizowaną wkładkę z PDMS w medium bezsurowiczym przez 24 godziny, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków gazu podczas umieszczania w dołkach płytki; hodować komórki MDCK lub inne komórki adherentne do 100% konfluencji w płytce sześciodołkowej, a następnie wykonać proste zadrapania w monowarstwach za pomocą końcówki pipety P 200. Zadrapania te symulują rany w adherentnej monowarstwie.

Odssać pożywkę komórkową, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy, a następnie przepłukać ją pięcioma mililitrami pożywki. Ponownie odessać płyn i napełnić studzienki trzema mililitrami pożywki bezsurowiczej. Ostrożnie wprowadzić urządzenie do płytki, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.

Wprowadzenie urządzenia pod kątem pomaga w usunięciu pęcherzyków powietrza jedną z jego stron. Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na urządzenie, co mogłoby doprowadzić do odkształcenia PDMS w stopniu wystarczającym do zmiażdżenia znajdujących się pod nim komórek. Umieść płytkę i urządzenie na podgrzewanym do 37 °C stole mikroskopu i podłącz rurki z butli z gazem źródłowym do portów wlotowego i wylotowego urządzenia.

Inkubator do hodowli powinien posiadać otwór umożliwiający wprowadzenie rurek, a rurki powinny zostać podłączone. Po umieszczeniu urządzenia w inkubatorze należy postąpić zgodnie z wcześniej opisaną procedurą uruchamiania przepływu gazu w celu oceny gojenia rany. Należy rejestrować obrazy poklatkowe komórek co 20 minut przez okres od 15 do 18 godzin, korzystając z opisanego wcześniej sprzętu i oprogramowania do obrazowania. Do analizy niezagojonej powierzchni po pożądanym czasie trwania eksperymentu można wykorzystać algorytm pomiarowy dla testu zarysowania (scratch assay). Następnie należy zatrzymać przepływ gazu, wyjąć płytkę i, jeśli jest to wymagane, przystąpić do dalszego przetwarzania komórek. Urządzenie z wkładką hipoksyczną wymaga mniej niż dwóch minut, aby ustabilizować poziom tlenu na poziomie 0.5%oxygen, jak pokazano tutaj.

Wielkość szczeliny przy dnie otworu membrany urządzenia była krytycznym czynnikiem określającym wydajność równoważenia, przy czym większe szczeliny wymagały więcej czasu do osiągnięcia stałych wartości stężenia tlenu. Urządzenie umożliwia również dużą kontrolę nad przestrzennym natlenieniem w pojedynczym otworze, co pozwala na tworzenie wielu warunków, a nawet generowanie cyklicznego profilu natlenienia na powierzchni otworu. Monowarstwy komórek MDCK poddano działaniu 10% lub 21% tlenu, a powierzchnia rany była analizowana w czasie przy użyciu algorytmu MATLAB Ts scratch wound tailing.

Po 11 z łącznie 17 godzin pozostało 6,87% pierwotnej rany przy ekspozycji na 10% tlenu, podczas gdy przy 21% tlenu pozostało 64,4% rany. Jak tutaj pokazano, stężenia tlenu są ujemnie skorelowane z powierzchnią otwartej rany dla obu stężeń tlenu. Przez cały czas trwania eksperymentu pokazaliśmy, jak wykonać, zwalidować i wykorzystać urządzenie z wkładką hipoksyczną do testu gojenia ran metodą scratch assay. Urządzenie to oferuje szereg zalet w porównaniu z innymi systemami natleniania, takimi jak mniejsza powierzchnia zajmowana w laboratorium oraz znacznie większa kontrola nad przestrzennym i czasowym natlenianiem powierzchni komórek.

Urządzenie może być wykorzystywane praktycznie w każdym laboratorium badającym wpływ tlenu lub innych gazów, takich jak dwutlenek węgla, na hodowle komórkowe in vitro. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wysterylizowane urządzenie oraz pożywki hodowlane namoczyć przez noc, a także zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza podczas eksperymentu. Ponadto należy pozwolić układowi na wyrównanie parametrów przed rozpoczęciem doświadczenia.

Dzieje się tak, ponieważ szybkość przepływu zmienia się w miarę wyrównywania się ciśnienia w układzie. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.