Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiału przepuszczającego gazy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie prawidłowego zastosowania naczyń w systemie zamkniętym z wykorzystaniem stosu Corning Hypers. Cel ten zostanie osiągnięty poprzez uprzednie zaszczepienie i napełnienie naczyń pożywką metodą grawitacyjną. Następnie zawiesina komórkowa zostanie wyizolowana w każdej z warstw, a komórki zostaną poddane inkubacji.

Po inkubacji zużyte medium zostaje usunięte. Ostatnim krokiem procedury jest pozyskanie komórek z naczyń systemu hypers stack. W rezultacie uzyskuje się wyniki dyfuzji gazów, które wykazują zdolność komórek do pobierania tlenu podczas wzrostu do stanu konfluencji przy użyciu zamkniętego systemu hypers stack.

Główną zaletą naczynia hypers stack z materiałem przepuszczalnym dla gazów jest zapewnienie zwiększonej powierzchni dla wzrostu komórek. Poprzez wyeliminowanie wolnej przestrzeni nad cieczą w naczyniu, mój kolega p pardo zaprezentuje teraz protokół systemu zamkniętego z wykorzystaniem naczynia hypers stack. Naczynie hypers stack składa się ze statu, czyli poszczególnej komory hodowli komórkowej, która tworzona jest przez płytkę górną oraz film przepuszczalny dla gazów.

Komórki są hodowane w tej komorze. Kolektor cieczy łączy ze sobą poszczególne warstwy ette w obrębie modułu. Moduły są połączone rurkami, tworząc naczynia składające się z wielokrotności 12 warstw.

Rozdzielacz umożliwia użytkownikowi przeprowadzenie jednej manipulacji płynem we wszystkich naczyniach jednocześnie. Rozdzielacz powietrza łączy również warstwy statyczne, ale służy do wypierania powietrza z naczyń podczas dodawania płynów i zawiera linię napełniania używaną podczas napełniania pomiędzy poszczególnymi etapami. Warstwa statyczna to otwarta przestrzeń powietrzna nazywana przestrzenią tchawkową, która umożliwia wymianę gazową poprzez gazoprzepuszczalną membranę każdej warstwy.

Przewody do transportu cieczy są podłączone do kolektora cieczy i stanowią konfigurowalny element służący do przeprowadzania wszystkich manipulacji płynami w układzie zamkniętym w celu usunięcia nadmiaru powietrza przy zachowaniu sterylności. Stosowane są również przewody odpowietrzające. Przewody odpowietrzające są podłączone do kolektora powietrza i zawierają filtr powietrza.

Do przewodów do obsługi cieczy podłączono przewód odprowadzający oraz filtr, które służą do usunięcia cieczy z przewodów po napełnieniu naczynia. W tym protokole wykorzystywany jest również manipulator Corning Stack (CSM), czyli urządzenie manipulacyjne pomagające w rozmieszczaniu naczyń w odpowiednich pozycjach podczas użytkowania. W niniejszej prezentacji przedstawiono hodowlę komórkową w systemie zamkniętym dla gazoprzepuszczalnego naczynia 36-warstwowego.

W przypadku zastosowania CSM szczegółowe informacje dotyczące wykonania tej procedury w naczyniu 12-warstwowym przy użyciu klina do napełniania znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Rozpocznij od przygotowania 3,9 litra pożywki w worku przed zaszczepieniem probówki z pożywką. Przenieś surowicę z worka do worka z pożywką i wymieszaj dokładnie, aby uzyskać pożądane stężenie surowicy.

Zaklemiej około 300 mililitrów pożywki w worku, używając dużych zacisków do worków. Dzięki temu wszystkie zaszczepione komórki zostaną wykorzystane podczas napełniania i żadne nie pozostaną w worku z pożywką. Umieść pożywkę na statywie do worków w celu przeprowadzenia szczepienia.

Napełnić strzykawkę z podłączonym przewodem zawiesiną komórkową. Przymocować strzykawkę zawierającą zawiesinę komórkową do worka z pożywką za pomocą zgrzewania przewodów. Pozostawić około 16 cali przewodu od strzykawki do worka.

Wstrzyknij zawiesinę komórkową do worka z medium i dokładnie wymieszaj. Zaszczepiony worek z medium można podłączyć do przewodów do obsługi cieczy w naczyniu o średnicy trzy ósemki cala poprzez spawanie przewodów lub przy użyciu złączy wielofunkcyjnych. Dzisiaj zastosujemy spawanie przewodów.

Zamknij zaciski na przewodach do dozowania cieczy i przewodach płuczących naczynia. Umieść 36-warstwowe naczynie w CSM w pozycji załadunkowej. Zaczep przewód filtra odpowietrzającego w uchwycie mocującym w CSM.

Dokręć pokrywkę i przesuń CSM do pozycji napełniania, aby umieścić filtr powietrza w najwyższym punkcie, co zapobiegnie jego zamoczeniu podczas procesu napełniania. Kąt 10 stopni umożliwia również wyrównanie poziomu cieczy w warstwach podczas napełniania, usuwając powietrze z linii napełniania. Ustaw worek z pożywką na tym samym poziomie co naczynie, utrzymując zamknięty zacisk rurki odprowadzającej.

Otwórz zacisk rurki do obsługi cieczy oraz zacisk worka z medium, aby umożliwić dopływ płynu do naczynia. Za pomocą statywu na worek unieś worek z medium, aby ułatwić przepływ zawiesiny komórkowej do naczynia. Napełniaj naczynie, aż całe zaszczepione medium zostanie do niego przelane.

W górnej części worka z pożywką powinno znajdować się nadal 300 ml pożywki. Zdejmij zacisk z worka z pożywką, aby kontynuować napełnianie naczynia, gdy ciecz zbliża się do górnego rozdzielacza powietrza. Zmniejsz szybkość napełniania, obniżając worek z pożywką, aby zapobiec przepełnieniu.

Powoli doprowadź poziom cieczy do linii napełniania i zaklemuj dreny układu dozowania cieczy. Przesuń naczynie w CSM do pozycji izolacyjnej, ustawiając oba zestawy rozdzielaczy w najwyższym położeniu. Obniż worek z pożywką poniżej poziomu naczynia.

Trzymając filtr płuczący w pozycji pionowej, otwórz zacisk rurki płuczącej. Spowoduje to opróżnienie lub wypłukanie medium z rurki do obsługi cieczy z powrotem do worka z medium. Po opróżnieniu rurki zamknij zacisk na rurce worka z medium.

Utrzymując filtr rurki odprowadzającej w pozycji pionowej, otwórz zacisk na rurce do obsługi cieczy naczynia, aby umożliwić pozostałej cieczy wpłynięcie i wyrównanie poziomu w naczyniu. Odczekaj od jednej do dwóch minut, aż proces ten zostanie zakończony.

Następnie obróć naczynie w module CSM tak, aby kolektory znajdowały się po lewej stronie. Obniż naczynie do pozycji załadunkowej w module CSM. Zamknij zaciski zarówno na przewodach odpływowych, jak i przewodach do obsługi cieczy.

Worek z pożywką można teraz zdjąć z naczynia lub pozostawić go przytwierdzonym do wykorzystania później w procedurze zbioru. Aby przechować przymocowany worek z pożywką, należy go zwinąć i umieścić pod pasami mocującymi w tacy do przechowywania naczynia. Na koniec przenieś naczynie do inkubatora. Podczas przenoszenia naczynia należy uważać, aby żadna ciecz nie przedostała się do filtra odpowietrzającego.

Osiąga się to poprzez lekkie pochylenie końca kolektora do góry. Aby rozpocząć procedurę zbioru, zespawaj rurkę z roztworem dysocjującym komórki oraz worki do gaszenia, tworząc zespół worków do zbioru; upewnij się, że wszystkie zaciski rurek są zamknięte. Wyjmij naczynie z inkubatora i umieść je w CSM w pozycji załadunkowej.

Zwolnij worek z medium spod opasek mocujących i zawieś go na uchwycie. Stojąc obok, mocno zakręć pokrywkę, aby zabezpieczyć naczynie. Wepnij rurkę odpowietrzającą do zacisku mocującego i przesuń CSM do pozycji napełniania.

Upewnij się, że worek z pożywką na statywie wisi niżej niż naczynie. Otwórz zacisk na drenie worka z pożywką oraz na drenie do transportu cieczy w naczyniu, aby umożliwić przepływ pożywki do podłączonego worka. Gdy naczynie będzie opróżnione w około trzech czwartych, zmień ustawienia CSM na końcową pozycję opróżniania.

Gdy naczynie i przewody do przekazywania cieczy będą puste, unieś przewód, aby przepchnąć medium poza zacisk na przewodzie worka z zużytym medium. Następnie zamknij oba zaciski: ten na przewodzie do przekazywania cieczy oraz ten na przewodzie worka z zużytym medium. Wymień worek z zużytym medium na zestaw worka do zbioru, stosując spawanie przewodów.

Za pomocą statywu do worków podnieś zespół worka do dysocjacji komórek powyżej wysokości naczynia. Umieść CSM w pozycji napełniania. Otwórz zacisk rurki z roztworem do dysocjacji komórek oraz zacisk zespołu worka do zbioru i przelej roztwór do naczynia.

Po zakończeniu przenoszenia zamknij zaciski na przewodach układu dozowania cieczy oraz na przewodzie z roztworem do dysocjacji komórek. Następnie, trzymając otwartą dźwignię pozycjonowania poziomego, przesuń CSM do pozycji załadunku. Delikatnie kołysz naczyniem na boki za pomocą koła, rozprowadzając roztwór po warstwach komórek.

Podczas kołysania naczynie można sporadycznie przywracać do pozycji napełniania, aby utrzymać równomierny rozkład roztworu. Po odpowiednim rozprowadzeniu roztworu należy zwolnić dźwignię w CSM, aby zablokować urządzenie w pozycji napełniania. Naczynie należy pozostawić w tej pozycji przez wymagany czas dysocjacji komórek.

Użyj mętności jako wskaźnika do określenia stopnia odrywania się komórek. Po ich odłączeniu przenieś CSM do pozycji załadunkowej. Otwórz zacisk worka z medium gaszącym oraz zacisk rurki do obsługi cieczy, aby umożliwić wpłynięcie medium gaszącego do naczynia.

Zamknij zacisk na przewodach układu dozowania cieczy. Po zakończeniu transferu przywróć CSM do pozycji załadunkowej i przytrzymaj dźwignię pozycjonowania poziomego, aby przechylić naczynie na boki. Korzystając ze stojaka na worki, obniż zespół worka do zbioru poniżej poziomu naczynia.

Ustaw CSM w pozycji pustej. Otwórz zacisk rury do obsługi cieczy w zbiorniku i przenieś roztwór komórek z powrotem do worka do gaszenia. Przywróć CSM do pozycji załadunkowej i odłącz zespół worka do zbioru od zbiornika za pomocą zgrzewarki do rurek.

Obecnie roztwór komórkowy jest gotowy do przetwarzania w tradycyjnych systemach hodowli komórek. W przypadku Headspace zawartość tlenu w pożywce ulega wyczerpaniu średnio o 50% w ciągu trzech dni. W hodowli wartość ta obrazuje spadek zawartości tlenu w miligramach na litr na poziomie komórek w czasie w tym samym systemie wzrostu; gradient tlenu przy wysokości pożywki wynoszącej 3 mm jest prawie o 50% większy na styku pożywki z Headspace niż na warstwie komórek.

Przedstawiono procentową zawartość tlenu w przestrzeni tchawkowej stosu hypers podczas wzrostu komórek. Rysunek pokazuje, że w ciągu 96 godzin procentowa zawartość tlenu między warstwami, który zasila każde gazoprzepuszczalne dno filmu, pozostaje stała. Dowodzi to zdolności komórek do dostępu do tlenu podczas wzrostu do stanu konfluencji.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak napełniać i zbierać produkt z naczynia typu stack Corning Hypers w systemie zamkniętym.