Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

W tej procedurze do oocytów Xenopus są wstrzykiwane transkrypty RNA znakowane fluorescencyjnie, a następnie monitorowana jest ich lokalizacja. W pierwszym kroku RNA jest znakowane nukleotydami fluorescencyjnymi.

W reakcji transkrypcji in vitro RNA jest następnie wprowadzane do aparatury do mikroiniekcji. Oocyty umieszcza się na płytce do iniekcji i poddaje starannej mikroiniekcji. Na koniec oocyty są hodowane, aby umożliwić lokalizację RNA przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Witajcie, jestem James Gagnan z laboratorium dr Kimberly Mallory w Departamencie Biologii Molekularnej, Biologii Komórki i Biochemii na Uniwersytecie Brown. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wizualizacji subkomórkowej lokalizacji RNA w oocytach Xap. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania architektury RNA oraz czynników białkowych niezbędnych do lokalizacji RNA podczas wczesnego rozwoju kręgowców.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, przeprowadź transkrypcję mRNA, które jest znakowane zarówno radioaktywnie, jak i fluorescencyjnie, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Dodaj DS w celu degradacji matrycy DNA, a następnie zatrzymaj reakcję poprzez dodanie EDTA.

Nieprzyłączone nukleotydy oraz inne małe cząsteczki należy usunąć poprzez wirowanie przez kolumnę G 50. Następnie RNA jest zagęszczane poprzez wytrącanie etanolem, przemywane i resuspenderowane. Po określeniu stężenia za pomocą liczenia scyntylacyjnego, należy rozcieńczyć RNA do stężenia 50 nM i przechowywać w aliquotach po 5 µL w temperaturze -80 °C.

Przed przystąpieniem do mikrowstrzyknięcia rozmrozić alikwot znakowanego RNA i denaturować w temperaturze 70°C przez pięć minut. Następnie wirować przez 10 minut z maksymalną prędkością w mikrowirowarce w temperaturze pokojowej w celu usunięcia cząsteczek stałych, a następnie przechowywać na lodzie. W dalszej kolejności wyizolować oocyty, przenosząc fragmenty jajnika Xenopus laevis do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu o stężeniu 3 mg/ml.

Kolagenaza w 0,1 molarnym buforze fosforanowym potasu o pH 7,4. Delikatnie mieszać w temperaturze 18°C ze względu na zmienność między partiami. Czas traktowania kolagenazą może być różny i powinien być starannie monitorowany poprzez inspekcję wizualną.

Aby zapewnić defoliację, należy kontynuować wstrząsanie przez 15 minut lub do momentu, aż oocyty zostaną widocznie oddzielone od jajnika, a następnie pozwolić oocytom opaść na dno probówki stożkowej. Usunąć roztwór i zastąpić go buforem MBSH. Powtórzyć tę czynność, płucząc dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania.

Następnie, pod standardowym mikroskopem świetlnym, ręcznie wyselekcjonuj cyty w stadium trzecim lub czwartym w buforze MBSH. Cyty w stadium trzecim są całkowicie nieprzezroczyste, ale białe. Z kolei cyty w stadium czwartym są nieco większe i nakrapiane pigmentem.

Oocyty, które są lekko przezroczyste, są zbyt młode, natomiast oocyty w pełni pigmentowane lub wykazujące polaryzację rozkładu pigmentu są zbyt stare. Na koniec przygotuj igły do mikroiniekcji, wykorzystując kapilary o długości trzech i pół cala; wyciągnij i ścinij je tak, aby uzyskać igły o średnicy zewnętrznej około 0,05 milimetra. Po przygotowaniu mRNA, oocytów oraz igieł można przystąpić do mikroiniekcji.

Zacznij od skalibrowania igły wodą dejonizowaną, aby dostarczać dwa nanolitry podczas każdego wstrzyknięcia. Napełnij igłę za pomocą mikrowstrzykiwacza sterowanego gazem i skalibruj wielkość kropli za pomocą mikrometru; po kalibracji napełnij igłę RNA przeznaczonym do wstrzyknięcia. Następnie umieść wyselekcjonowane oocyty na płytce do iniekcji w buforze MBSH; płytka zawiera warstwę czarnej pianki gumowej.

Białe oocyty wyraźnie odcinają się od czarnego tła. Następnie ostrożnie wstrzyknij do każdego oocytu 2 µL RNA w stężeniu 50 nM. Należy upewnić się, że do każdego oocytu wykonano tylko jedną iniekcję, a po zakończeniu procesu regularnie sprawdzać, czy igła nie jest zapchana.

Usunąć pozostałe RNA, wypłukać igłę wodą destylowaną i nabrać kolejną porcję RNA do iniekcji. Po iniekcji przenieść wstrzyknięte cytocyty do dołka sterylnej płytki 24-dołkowej; w jednym dołku można hodować do tysiąca CYTES.

Usuń bufor i zastąp go 400 µL pożywki do hodowli cyte na każdą studzienkę. Następnie umieść płytkę hodowlaną w plastikowym pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgotne środowisko podczas hodowli; inkubuj oocyty w temperaturze 18 °C przez czas od 8 do 48 godzin, zależnie od pożądanego okresu inkubacji. Po inkubacji wstrzykniętych oocytów można je przygotować do analizy mikroskopowej.

Odsiać martwe oocyty, a pozostałe przenieść do szklanych fiolek. Rutynowo obserwuje się przeżywalność powyżej 90% oocytów. Zastąpić bufor utrwalaczem M-E-M-F-A i inkubować oocyty w ruchu kołyszącym przez 20 minut.

Chroń oocyty przed światłem słonecznym podczas i po zakończeniu procesu fiksacji. Przemyj oocyty, usuwając utrwalacz i zastępując go równą objętością buforu MBSH. Powtórz to przemywanie jeszcze raz, aby w sumie przeprowadzić dwa przemycia.

Następnie przemyj oocyty w bezwodnym metanolu. Najpierw usuń połowę objętości i zastąp ją metanolem. Powtórz tę czynność jeszcze dwa razy.

Po tych etapach przemywania odessać cały roztwór i zastąpić go metanolem. Powtórzyć przemywanie metanolem jeszcze raz. Utrwalone i odwodnione oocyty można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu obrazowania.

Przed obrazowaniem należy dodać medium przejrzystościącego Marie do szklanego naczynia fluoro WPI, aby pokryć powierzchnię obrazowania. Ostrożnie przenieść oocyty z metanolu do naczynia fluoro, minimalizując objętość przenoszonego metanolu. Obrazować oocyty za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego; zarówno Zeiss LSM 510, jak i Leica TCS SP dają dobre wyniki. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne obrazy subkomórkowej lokalizacji RNA bezpośrednio po mikroiniekcji; fluorescencyjne RNA można zaobserwować w jądrze po ośmiu godzinach hodowli kontroli znakowanej fluorescencyjnie.

Można zauważyć, że RNA jest rozłożone równomiernie w cytoplazmie oocyta. Jednakże RNA znakowane fluorescencyjnie, zawierające sekwencje rekrutujące aparat transportowy, można zaobserwować w procesie lokalizacji subkomórkowej w biegunie wegetatywnym oocyta. Przedstawiliśmy właśnie sposób mikroiniekcji znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek RNA do oocytów oraz obserwacji lokalizacji RNA przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie roztworów traktowanych DEPC, aby uniknąć kontaminacji RNA w hodowli, hodowanie oocytów w pożywce OCM zawierającej antybiotyki oraz chronienie oocytów przed światłem słonecznym, kiedy tylko jest to możliwe, aby uniknąć fotowyblaknięcia. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.