Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Celem poniższego eksperymentu jest rejestracja procesów dynamicznych w żywych miejscach U (U sites) u drozofili. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw nienaruszonych jajników z dobrze odżywionych, dwudniowych samic much. W drugim kroku z jajników wyekstrahowane są poszczególne owulariach w celu obrazowania komór jajeczkowych.

Następnie, jeśli wykazują one ekspresję odpowiedniego białka fluorescencyjnego, poszczególne komory jajowe mogą być obrazowane bezpośrednio lub poddane dalszym manipulacjom, takim jak mikroiniekcja markerów fluorescencyjnych przed obrazowaniem. Ostatecznie, poprzez analizę sekwencji filmowych, można ujawnić dynamiczne interakcje komponentów wewnątrzkomórkowych. Metoda ta pomogła nam odpowiedzieć na niektóre kluczowe pytania w dziedzinie transportu RNA i translacji lokalnej.

Na przykład, w jaki sposób w żywym organizmie regulowana jest w czasie i przestrzeni ekspresja białek ustalających plan budowy ciała? Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą napotykać trudności, ponieważ wymaga ona znacznej szybkości i zręczności. Lepsze wyniki zostaną osiągnięte dzięki praktyce.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ manipulacje w komorach jajowych są trudne do przekazania w tekście, a wymagają one cierpliwości, wiedzy technicznej i pewności w ruchach. Rozpocznij procedurę od naniesienia małej kropli oleju halokarbonowego na szkiełko nakrywkę i odstaw je na bok. Następnie znieczul przygotowane muchy dwutlenkiem węgla.

Używając ostrych pęsety z cienkimi końcami, chwyć tuczoną samicę muchy w przedniej części odwłoka. Nie chwytaj w środkowej części odwłoka. Trzymaj samicę mniej więcej dwa do trzech centymetrów nad przygotowanym szkiełkiem nakrywką.

Używając drugiej pary pęsety, usuń tkanki z najdalej położonej części tylnej samicy. Zazwyczaj obejmie to tkanki jelitowe; użyj do tego czystej pęsety. Delikatnie masuj odwłok od końca przedniego w stronę tylnej, podobnie jak przy wyciskaniu pasty z tubki.

Jajniki wyglądają jak duże, nieprzezroczyste struktury i będą przylegać do końcówki pęsety. Zbierz jajniki, dotykając nimi warstwy oleju węglowego na szkiełku. Następnie powtórz ten proces, aż do zebrania od czterech do sześciu jajników.

Przed izolacją narządów głowowych należy dostosować źródło światła w mikroskopie tak, aby oświetlenie padało na preparat pod niewielkim kątem, tworząc kontrastujące cienie na tkankach. Podczas sekcji much bardzo ważne jest użycie odpowiednich narzędzi.

Używany przez nas wskaźnik nie jest zbyt ostry, aby nie uszkodzić tkanki, lecz dość tępy, co pozwala na uchwycenie używanych pęset. Podobnie, nie są one zbyt ostre, by nie uszkodzić tkanek, ale na tyle precyzyjne, aby umożliwić manipulację bez wyginania narzędzia. Bardzo ważne jest również zachowanie czystości narzędzi, dlatego regularnie czyścimy je w trakcie procedury, używając zamkniętych kleszczyków.

Oddziel oba jajniki, usuwając tkankę łączną na ich tylnym końcu. W tylnej części znajdują się najbardziej dojrzałe komory z jajeczkami. Ułóż jajnik poziomo tak, aby najmłodsze komory z jajeczkami znajdowały się po stronie ręki dominującej.

Następnie delikatnie uchwyć tylny koniec za pozostałą tkankę łączną i użyj sondy sekcyjnej lub igły wolframowej, aby wyizolować poszczególne owulariów; komory jajowe od stadium Jamar do stadium 10 oddzielą się od siebie, natomiast starsze komory jajowe pozostaną przytwierdzone do jajnika. Za pomocą sondy ostrożnie przesuń od 15 do 25 oddzielonych owulariów do centrum kropli oleju. Jeśli konieczne jest wypreparowanie więcej niż jednego jajnika, wybierz go z innej muchy.

Usunąć nadmiar tkanki jajnika i pracować szybko, ponieważ cyty zaczną wykazywać zmiany fenotypowe wynikające ze stresu. Po 40 minutach od wycięcia z jajnika, usunąć nadmiar tkanki jajnika z oleju. Używając czystych narzędzi do iniekcji cytów w stadium średnim, zorientować aeriale prostopadle do długiej osi szkiełka nakrywki. Aby wyizolować komory jajowe w stadium późnym.

W przypadku uchwycenia tylnej części jajnika, zgodnie z wcześniejszym opisem, wymagana jest inna metoda. Wprowadź sondę sekcyjną do tylnego końca jajnika w pobliżu pęsety. Aby uniknąć przebicia komór jajowych, wprowadź sondę pomiędzy komory jajowe w późnym stadium rozwoju.

Przesuń igłę sekcyjną przez jajnik, aż wyjdzie ona w obrębie komór jajowych na wczesnym etapie rozwoju. Przy prawidłowym wykonaniu zabiegu sonda usunie tkankę łączną utrzymującą owulariów oraz komory jajowe na późnym etapie rozwoju w miejscu. Powtarzaj ten krok, aż owulariów zostaną rozłożone na szkiełku nakrywce.

Krok ten jest zakończony, gdy komory jajowe nie są już ułożone jedna na drugiej. Za pomocą sondy do sekcji oddziel późne stadia komór jajowych, aby ułatwić obrazowanie i ustawienie stadium 14. Do chwycenia wyrostków grzbietowych komór szyjnych użyj pęsety.

Przygotuj roztwory do wstrzyknięcia, krótko wirując je przy wysokiej prędkości. Pozwoli to na odwirowanie wszelkich osadów stałych, które mogłyby zablokować igłę wstrzykującą. Następnie pobierz roztwór do igły za pomocą końcówki do ładowania i ostrożnie przymocuj napełnioną igłę do wtryskiwacza.

Teraz umieść mały kawałek szkła obok próbek i zamocuj preparat na stoliku mikroskopu. Szkło będzie służyć jako ścianka do przerywania lub rozdzielania. Wyjmij igłę.

Przygotuj mikroskop oraz aparat do mikroiniekcji do przeprowadzenia eksperymentu. Należy uważać, aby nie złamać końcówki igły. Jeśli to możliwe, użyj zautomatyzowanego stolika z funkcją zapamiętywania punktów, aby oznaczyć wszystkie cyty na etapie ósmym i dziewiątym przeznaczonych do iniekcji.

Teraz należy opuścić igłę wstrzykującą, aż dotknie ona oleju. Wybierz pierwszy punkt z listy zaznaczonych punktów i ustaw ostrość na komórce. Ręcznie opuść igłę, aż znajdzie się ona w tej samej płaszczyźnie ostrości co komórka.

Używając sterowników manipulatora, przesuń końcówkę igły wstrzykującej, aż znajdzie się ona w obszarze U. Szybki ruch wbijania jest często skuteczniejszy niż ruch powolny. Po wprowadzeniu igły, wstrzyknij niewielką objętość z igły i dokonaj wizualnej oceny efektów.

Wymagane jest powtórzenie czynności. Jeśli iniekcja przebiegnie pomyślnie, cytoplazma wewnątrz cyty zostanie przemieszczona. Precyzyjna ilość wstrzykniętego płynu jest trudna do określenia.

Aby zwiększyć objętość iniekcji, należy dostosować ciśnienie lub czas trwania impulsu wstrzykiwania. Można złamać końcówkę igły, aby nieznacznie powiększyć jej otwór, lub po prostu zastosować kilka impulsów iniekcyjnych przed wybraniem kolejnego mark.Cyte. Unieś igłę iniekcyjną w oleju na tyle wysoko, aby nie uderzała ona o inne cytes.

Wielokrotne nakłuwanie lub zbyt długie pozostawianie igły wewnątrz cyty powoduje poważne uszkodzenie komory jajeczka. Należy zatem działać szybko. Iniekcja powinna trwać mniej niż 10 sekund.

W przypadku popełnienia błędu, przejdź do kolejnego punktu oznaczenia. Nie marnuj czasu na uszkodzone miejsca. Gdy igła zostanie zapchana, przenieś ją do rozbitego kawałka szkła.

Gdy szkło i igła znajdą się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, ostrożnie wbij igłę w szkło. Sprawdź, czy igła nie jest zapchana, naciskając przycisk wtrysku i obserwując, czy z końcówki igły wypływa płyn. Po wstrzyknięciu we wszystkie miejsca US ręcznie wyjmij igłę z oleju i odsuń ją z toru wiązki światła mikroskopu.

Upewnij się, że próbka jest ustawiona w bezpiecznej orientacji, aby uniknąć uszkodzenia oczu, a światła są wyłączone. W celu usprawnienia obrazowania fluorescencyjnego kluczowe jest zachowanie szybkości pracy. Jeśli od momentu izolacji komór jajowych do iniekcji cytów upłynie godzina lub więcej, cyty będą trudne do iniekcji i wykażą zmiany fenotypowe związane ze stresem.

Podobne problemy mogą wystąpić w przypadku gwałtownego obchodzenia się z cyte lub wstrzyknięcia nadmiarowych objętości. Komory jajowe wykazujące ekspresję trenchgenicznych białek fluorescencyjnych mogą być obrazowane bez konieczności iniekcji. Markowanie endogennego RNA metodą MS two można obrazować z dobrymi wynikami, stosując procedury izolacji tkanek z wykorzystaniem pełnego procesu syntezy in vitro.

Do komory jajowej ME 31 BGFP wstrzyknięto RNA Alexa, 5 46 kin; RNA zlokalizowało się w przednio-grzbietnej części cyty i utworzyło czapkę wokół jądra. Po opanowaniu ta technika może zostać przeprowadzona w około 10 minut, od momentu sekcji do rozpoczęcia obrazowania. Podczas wykonywania tej procedury należy dbać o tkankę, pracując szybko, ale uważnie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak rejestrować dynamiczne procesy w żywych cytach Drosophila.