Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Wyznaczanie zawartości i składu ligniny w ścianach komórkowych roślin rozpoczyna się od wysuszonego materiału roślinnego, który poddawany jest różnym ekstrakcjom. Otrzymany materiał składa się wyłącznie ze ścian komórkowych, a następnie jest on rozdzielany w celu określenia zawartości ligniny. Materiał ścian komórkowych poddawany jest hydrolizie za pomocą bromku acetylu, a rozpuszczone monomery są ilościowo oznaczane metodą spektrometrii UV w celu ustalenia składu ligniny.

Materiał ścian komórkowych jest hydrolizowany poprzez cytolizę. Rozpuszczone składniki ligniny są następnie przekształcane w ich lotne pochodne trimetylosilanowe, które można rozdzielić i określić ilościowo za pomocą chromatografii gazowej w połączeniu ze spektrometrią mas. Wyznaczenie składu polisacharydowego macierzy oraz zawartości celulozy zostało przedstawione w innym filmie pod tytułem Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates.

Witajcie, jestem Marcus Pauley, kierownik laboratorium analizy ścian komórkowych w Great Lakes Bioenergy Research Center na Michigan State University. Jestem Cliff Foster, manager laboratorium analizy ścian komórkowych. Zaprezentujemy Państwu procedurę określania zawartości i składu próbek biomasy roślinnej.

Rośliny przekształcają energię świetlną słońca w energię chemiczną, taką jak biomasa. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, złożonej sieci różnorodnych polimerów otaczających wszystkie komórki roślinne. W niniejszej pracy określamy skład materiałów ścian komórkowych roślin, aby ocenić potencjał przekształcania tych lignin Cellose X, które stanowią wysoce dostępny odnawialny zasób, w biopaliwa.

Dzisiaj skupimy się na polifenolowej ligninie w kolejnym filmie zatytułowanym Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część druga: węglowodany. Skupimy się na analizie polisacharydów. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać trzy stalowe kulki o średnicy 5,5 mm do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml oraz około 60 do 70 mg liofilizowanego materiału roślinnego.

Materiał można zmielić na drobny proszek, używając urządzenia eyewall, czyli robota do mielenia i dozowania. Urządzenie eyewall przejmuje probówkę i wstrząsa nią przez 30 s, podczas czego dzięki metalowym kulkom materiał zostaje zmielony na drobny proszek; następnie zmielony, lecz zbity proszek roślinny rozluźnia się za pomocą alternatywnej, nierobotycznej procedury o niskiej przepustowości. Część druga przedstawia ułatwienie procesu ekstrakcji; do zmielonego materiału należy dodać 1,5 M 70% etanolu wodnego, dokładnie wymieszać na wortexie i odwirować w temperaturze pokojowej.

Obróbka ta solubilizuje większość białek i organelli komórkowych; odessaj nadsącz i dodaj objętość roztworu chloroformu i metanolu w stosunku jeden do jednego do osadu nierozpuszczalnego w alkoholu. Wstrząśnij dokładnie, aby zawiesić osad, a następnie odwiruj w wirówce. Chloroform i metanol ekstrahują związki hydrofobowe, takie jak lipidy; po wirowaniu odessaj nadsącz i resuspenduj osad w 500 µL acetonu.

Aby osuszyć próbkę, odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35 °C aż do całkowitego wyschnięcia; wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania. Aby rozpocząć usuwanie skrobi z osadów próbek, zawiesić pellet w 1,5 ml 0,1 M octanu sodu o pH 5, zamknąć probówki i ogrzewać w bloku grzewczym w celu żelatynizacji skrobi. Po schłodzeniu zawiesiny na lodzie dodać mieszaninę enzymów degradujących skrobię, zamknąć probówkę i dokładnie wymieszać w wstrząsaczu typu vortex, a następnie inkubować zawiesinę przez noc.

W wytrząsarce w temperaturze 37 °C wytrząsarka rotacyjna zapewnia odpowiednie mieszanie. Po inkubacji nocnej przerwać trawienie poprzez ogrzewanie w bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Następnie odwirować i usunąć supernatant, który zawiera rozpuszczoną skrobię.

Pozostały osad przemyj trzy razy, używając za każdym razem 1,5 ml wody, poprzez mieszanie w wortexie, wirowanie i odlewanie, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Na koniec resuspenduj osad w 500 µL acetonu i odparuj rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35 °C aż do całkowitego wyschnięcia. Wysuszone próbki zawierające wyizolowaną ścianę komórkową lub leg, no celluloses są gotowe do dalszych analiz i mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej.

Zacznij od odważenia od 1 do 1,5 mg przygotowanego materiału ścian komórkowych. Materiał można odważyć ręcznie lub w sposób zautomatyzowany przy użyciu ściany oka, tak jak pokazano w części drugiej. Przepłucz ścianki probówki 250 µL acetonu, aby zebrać materiał ścian komórkowych na dnie probówki, a następnie bardzo ostrożnie odparuj aceton w strumieniu powietrza.

Po odparowaniu acetonu ostrożnie dodaj 100 µL świeżo przygotowanego 25% obj. acetylobromku w lodowatym kwasie octowym wzdłuż ścianek naczynia. Aby uniknąć rozbryzgów, delikatnie dodawaj odczynnik; bromek rozkłada polimer ligninowy na acetylowane monosacharydy. Następnie zamknij kolbę miarową i podgrzewaj w temperaturze 50 °C przez dwie godziny.

Podgrzewaj przez dodatkową godzinę, mieszając co 15 minut, a następnie schłódź na lodzie. Po schłodzeniu kolby w temperaturze pokojowej dodaj 400 µL 2 M wodorotlenku sodu i 70 µL świeżo przygotowanego 0,5 M chlorowodorku hydroksyloaminy, a następnie wymieszaj kolby miarowe w wirówce typu vortex. Następnie zneutralizuj roztwór, dopełniając kolbę miarkową dokładnie do kreski 2 mL octem lodowatym, zakręć i odwróć kilka razy w celu wymieszania. Pipetą przenieś 200 µL roztworu zawierającego zhydrolizowane i rozpuszczone monomery do płytki 96-dołkowej przeznaczonej do analiz UV i odczytaj wartości w czytniku płytek przy 280 nm. Odczytaj płytkę co najmniej trzy razy i wyciągnij średnią z absorbancji, ponieważ cząstki stałe mogą powodować niewielkie różnice w wartościach absorbancji.

Wyznacz procentową zawartość ligniny rozpuszczalnej w bromku (BSL), stosując odpowiedni współczynnik roślinny oraz wzór przedstawiony w protokole pisemnym. Lignina jest siecią polifenolową składającą się głównie z trzech podjednostek: p-hydroksyfenylu, guajakolu i syringolu; w celu określenia składu ligniny w materiale roślinnym, należy rozpocząć od przeniesienia około 2 mg materiału ścian komórkowych do szklanej probówki z nakrętką w celu przeprowadzenia cytolizy.

Następnie należy przygotować 2,5% BF₃·OEt₂ oraz 10% roztwór etanotiolu w dioksanie. Ze względu na wysoką toksyczność dioksanu, nie należy wyjmować żadnych próbek ani sprzętu z dygestorium. Należy pracować bardzo ostrożnie i użyć balonu wypełnionego azotem, aby zastąpić utraconą objętość w butelce z dioksanem azotem.

Przygotuj roztwór, mieszając następujące objętości na próbkę: 175 µL dioksanu, 20 µL ETSH oraz 5 µL BF3. Po wymieszaniu dodaj 200 µL roztworu do każdej próbki. Przepłucz przestrzeń nad próbką w fiolce azotem i zamknij.

Przejdź niezwłocznie do podgrzewania próbek w temperaturze 100 °C przez cztery godziny, delikatnie mieszając je na koniec każdej godziny. Przerwij reakcję lizy, chłodząc próbki na lodzie przez pięć minut. Następnie dodaj 150 µL 0,4 M wodorowęglanu sodu w celu neutralizacji i wymieszaj na wortexie.

W celu oczyszczenia produktów rozkładu ligniny dodać 1 ml wody oraz 0,5 ml octanu etylu, wymieszać w wstrząsarze typu vortex i poczekać do rozdzielenia się faz. Warstwa octanu etylu znajdzie się na górze, a woda na dole. Przenieść 150 µL górnej warstwy octanu etylu zawierającej składniki ligniny do probówki o pojemności 2 ml, upewniając się, że nie przeniesiono wody.

Po przeniesieniu z górnej warstwy octanu etylu odparuj rozpuszczalnik za pomocą koncentratora z przepływem powietrza. Dodaj 200 µL acetonu i odparuj. Powtórz zabieg z użyciem acetonu dwukrotnie, aby usunąć nadmiar wody.

Następnie należy przeprowadzić derywatyzację składników ligniny do ich lotnych pochodnych trimetylsylowych. Do każdej probówki należy dodać 500 µL octanu etylu, 20 µL pirydyny oraz 100 µL BSTFA (N,O-bis(trimetylsylo)trifluoroacetamidu). Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 25 °C.

Po upływie dwóch godzin przenieś 100 µL reakcji do fiolki do GC MS i dodaj 100 µL acetonu. Próbki należy przeanalizować za pomocą GC wyposażonego w kwadrupolowy spektrometr mas lub detektor jonizacji płomieniowej. W celu uzyskania informacji na temat kolumny oraz szczegółów przebiegu analizy należy zapoznać się z towarzyszącym protokołem pisanym.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy ligniny z wykorzystaniem drewna topoli jako materiału roślinnego. Zgodnie z tą analizą 22% materiału z topoli składa się z ligniny polifenolowej. Skład komponentów ligniny przeanalizowano za pomocą GCMS.

Piki są identyfikowane na podstawie względnych czasów retencji przy użyciu wewnętrznego standardu tetrakoanu lub poprzez charakterystyczne jony widma masy 299 m/z, 269 m/z i 239 m/z odpowiednio dla monomerów s, g i h. Skład komponentów ligniny jest ilościowo określany poprzez ustawienie całkowitej powierzchni pików na 100%. Analiza składu wykazuje, że ta konkretna próbka zawiera głównie jednostki s. Jednakże jednostki g są również liczne.

Oczywiście ilość i skład jednostek monomerycznych mogą się różnić w zależności od tkanki roślinnej i gatunku. Przedstawiliśmy sposób określania zawartości i składu ligniny w materiale roślinnym na potrzeby analizy polisacharydów. Przejdź do drugiej części.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.