Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Wyznaczanie składu polisacharydów macierzy oraz zawartości krystalicznej celulozy w ścianach komórkowych roślin rozpoczyna się od wysuszonego materiału roślinnego, który poddawany jest różnym ekstrakcjom. Uzyskany materiał składa się wyłącznie ze ścian komórkowych, a następnie jest dzielony w celu określenia składu polisacharydów macierzy. Materiał ścian komórkowych traktuje się słabym kwasem, aby zhydrolizować niekrystaliczne polisacharydy, głównie hemicelulozy, do ich monosacharydów.

Monosacharydy są następnie przekształcane w odpowiadające im lotne octany aldolowe, które następnie poddawane są analizie i kwantyfikacji za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrem mas w celu oznaczenia celulozy krystalicznej. Ściany komórkowe traktuje się odczynnikiem graficznym, będącym mieszaniną kwasów, które usuwają niekrystaliczne komponenty ścian. Pozostała celuloza krystaliczna jest degradowana do monomeru glukozy, który może być oznaczany kolorymetrycznie.

Wyznaczanie zawartości i składu ligniny zostało zaprezentowane w innej publikacji wideo JoVE zatytułowanej Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część pierwsza Lignina. Witajcie, jestem Marcus Pauley, kierownik laboratorium analitycznego ścian komórkowych w Great Lakes Bioenergy Research Center na Michigan State University. Jestem Cliff Foster, menedżer laboratorium analitycznego ścian komórkowych.

Dzisiaj pokażemy Państwu, jak określić skład polisacharydów obecnych w materiale ścian komórkowych roślin, czyli celulozie w różnych rodzajach celuloz Homo. Tutaj, w Great Lakes Bioenergy Research Center, opracowujemy technologię przetwarzania tych cukrów na biopaliwa. Aby zidentyfikować optymalny surowiec roślinny, musimy najpierw ocenić rodzaj i zawartość cukrów obecnych w tej biomasie.

W innym filmie pod tytułem Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część pierwsza: Lignina, skupimy się na analizie polifenoli. Zacznijmy zatem. Procedurę tę należy rozpocząć od izolacji ścian komórkowych.

Rozetrzeć około 60 do 70 miligramów wysuszonego materiału roślinnego za pomocą kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 5,5 milimetra w probówce z nakrętką SAR TED o pojemności dwóch ml. Jako wysokoprzepływową alternatywę dla młyna REM należy wykorzystać robota do mielenia i dozowania o nazwie eyewall, zgodnie z opisem w części pierwszej. Po zakończeniu mielenia należy usunąć stalowe kulki.

Kontynuuj izolację ścian komórkowych i usuwanie pozostałości skrobi zgodnie z procedurą przedstawioną w pierwszej części oraz opisaną w towarzyszącym protokole pisemnym. Odważ dwa miligramy materiału ścian komórkowych skrobi DS do probówki typu 2 ml. Wysokoprzepustowym sposobem wykonania tego zadania jest użycie robota eyewall.

Robot pobiera probówkę zawierającą zmielony materiał roślinny i wykonuje otwór w dnie probówki. Przebita probówka jest następnie umieszczana w podajniku VI. Pusta probówka zostaje umieszczona na wadze i przesunięta pod podajnik VI; za pomocą wibracji materiał przesiąka przez otwór w napełnionej górnej probówce do pustej dolnej probówki, aż do momentu zgromadzenia pożądanej ilości materiału.

Dodaj 100 µg acetolu jako standard wewnętrzny. Przepłucz ścianki probówki acetonem, aby zebrać materiał ścian komórkowych na dnie probówki, a następnie bardzo delikatnie odparuj aceton pod strumieniem powietrza. Następnie przeprowadź hydrolizę słabym kwasem.

Ostrożnie dodaj 250 µL 2 M kwasu trichlorooctowego lub TFA do każdej próbki, dbając o to, aby materiał nie rozprysnął się na ścianki probówek. Szczelnie zakręć probówki i inkubuj w bloku grzewczym w temperaturze 121 °C przez 90 minut. Następnie schłodź bloki grzewcze i próbki na lodzie, a potem wiruj probówki przy 10 000 RPM przez 10 minut.

Przenieś 100 µL kwaśnego supernatantu zawierającego rozpuszczone cukry polisacharydu macierzy do fiolek z nakrętką, uważając, aby nie naruszyć osadu. Osad można wykorzystać do oznaczenia celulozy krystalicznej. Odparuj TFA w szklanej probówce pod łagodnym strumieniem powietrza w urządzeniu do odparowywania.

Dodaj 300 µL propan-2-olu, aby usunąć nadmiar kwasu, wymieszaj w wortexie i odparuj w temperaturze 25 °C. Powtórz czynność łącznie trzy razy. W celu umożliwienia identyfikacji monosacharydów za pomocą chromatografii gazowej przeprowadź derywatyzację do octanu aldolu.

W pierwszej kolejności należy zredukować monosacharydy do odpowiadających im otwartych pierścieni aldoli, które następnie poddaje się acetylacji. Szczegółowe instrukcje znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Każdy etap procedury przebiega zgodnie z wcześniej przedstawionym protokołem: dodanie odczynnika, inkubacja, odparowanie strumieniem powietrza, a następnie usunięcie nadmiaru odczynnika poprzez kolejne etapy przemywania.

W końcowych etapach przeprowadza się ekstrakcję octanów aldolowych. Najpierw należy dodać 500 µL octanu etylu i lekko zamieszać. Następnie dodać 2 mL wody, zamknąć probówki i wymieszać w wstrząsarce typu vortex. Probówki należy odwirować przy 2000 RPM przez pięć minut, aby uzyskać wyraźnie oddzielone warstwy, z octanem etylu na górze, zawierającym octany aldolowe, oraz wodą na dole. Następnie należy pipetować 50 µL warstwy octanu etylu do fiolek GC-MS z wkładkami. Próbkę rozcieńcza się, dodając 100 µL acetonu do fiolki GC; tak przygotowane fiolki można przechowywać w temperaturze 4 °C.

Jeśli analiza GCMS nie zostanie przeprowadzona niezwłocznie, należy wstrzyknąć próbki do chromatografu gazowego wyposażonego w kwadrupolowy spektrometr mas. W celu uzyskania informacji na temat kolumny oraz szczegółów przebiegu analizy prosimy o zapoznanie się z towarzyszącym protokołem pisemnym. Materiałem wyjściowym do oznaczania zawartości celulozy krystalicznej może być wyizolowany materiał ścian komórkowych lub materiał ścian poddany uprzednio działaniu słabego kwasu TFA, albo bezpośrednio po obróbce kwasowej, albo w formie wysuszonej przeznaczonej do przechowywania.

Po usunięciu nadmiaru TFA izopropanolem, zgodnie z wcześniej opisananą procedurą, do osadu TFA w probówkach dodaj 1 M odczynnika do degradacji, składającego się z kwasu octowego, kwasu azotowego i wody, w stosunku objętościowym od 8:1 do 2:1. Szczelnie zamknij probówkę, wymieszaj w wstrząsarzu Vortex i inkubuj na bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 30 minut. W wyniku tej obróbki w osadzie pozostaje jedynie celuloza krystaliczna.

Wszystkie pozostałe polisacharydy poddaje się hydrolizie. Próbki schładza się w bloku na lodzie do temperatury pokojowej lub niższej. Następnie próbki wiruje się z prędkością 10 000 RPM przez 15 minut. Po wirowaniu odrzuca się nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć osadu i nie usunąć żadnego materiału z niego pochodzącego. W tym celu w probówce pozostawia się około 150 µL nadsączu, a następnie kilkukrotnie przemywa osad wodą.

Następnie przeprowadź hydrolizę kwasową przy użyciu stężonego kwasu siarkowego, aby całkowicie zhydrolizować kryształy i pelet celulozy do glukozy. Rozpocznij od dodania 175 µL 72% kwasu siarkowego do probówki typu sarta i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po wstępnej inkubacji wymieszaj próbkę w wortexie i inkubuj przez kolejne 15 minut.

Następnie należy dodać 825 µL wody, wymieszać na wirówce typu vortex, a następnie odwirować próbki przy 10 000 RPM przez pięć minut. W probówce może pozostać pewna ilość brązowego, rozpuszczalnego materiału, głównie ligniny, podczas gdy glukoza znajduje się w nadfiltracie. Zawartość glukozy w nadfiltracie oznacza się za pomocą kolorymetrycznego testu antonowego.

Analizę tę przeprowadza się w 96-dołkowej polistyrenowej płytce mikrotytrującej. Należy przygotować krzywą wzorcową dla glukozy w dwóch powtórzeniach, zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym protokole pisemnym. Próbki przygotowuje się, łącząc 10 µL każdej próbki (nadpłynu) z 90 µL wody w osobnych dołkach tej samej płytki mikrotytrującej, co wzorce, a następnie dodając 200 µL świeżo przygotowanego odczynnika.

Następnie podgrzewaj płytkę przez 30 minut w temperaturze 80 °C w piekarniku z aluminiowym rozpraszaczem ciepła. Zauważ, że próbki zawierające glukozę zmieniają kolor z żółtego na niebiesko-zielony po zakończeniu podgrzewania. Pozostaw płytkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej i dokładnie wstrząśnij.

Odczytaj absorbancję przy 625 nanometrach za pomocą czytnika płytek mikrotytrowych. Zawartość glukozy, będącej jednostką budulcową celulozy, oblicza się na podstawie absorbancji w odniesieniu do krzywej wzorcowej wyznaczonej na tej samej płytce. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy polisacharydów fragmentu drewna topoli.

Piki na chromatogramie gazowym są identyfikowane na podstawie profilu masy i/lub czasów retencji standardów. Monosacharydy są ilościowo określane na podstawie krzywych wzorcowych. Analiza cukrów polisacharydów matrycy wykazuje wysoką zawartość ksylozy, reprezentującej hemicelulozę xam, choć obecne są również inne cukry.

Z analizy wynika, że 40% materiału topolnego składa się z kryształów i celulozy. Należy pamiętać, że zawartość i skład tych komponentów mogą się różnić w zależności od rośliny lub pomiędzy różnymi strukturami anatomicznymi rośliny. Przedstawiliśmy sposób wyznaczania zawartości polisacharydów oraz analizy składu biomasy lignocelulozowej w celu analizy ligniny polifenolowej.

Zapraszamy do obejrzenia pierwszej części. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.