Znaczenie prawidłowego stężenia białka dla wyznaczania kinetyki i powinowactwa w analizie zależności struktura-funkcja

Ogólnym celem niniejszego artykułu wideo jest udzielenie odpowiedzi na następujące dwa pytania. Po pierwsze, czy badania oddziaływań białkowych mogą stać się bardziej wiarygodne dzięki pomiarowi frakcji próbki białka, która jest faktycznie zdolna do wiązania się z innym białkiem? Po drugie, w jaki sposób analiza kinetyczna może zapewnić nam lepsze zrozumienie zależności między strukturą a funkcją?

Oba te pytania zostaną rozważone w eksperymencie z wykorzystaniem Corp X 100, urządzenia wykrywającego oddziaływania białkowe w czasie rzeczywistym bez użycia znaczników. Eksperyment ten zbada oddziaływanie wołowej cystatyny B z cysteinową proteazą papainą; struktura krystaliczna kompleksu obu białek wskazuje na kilka reszt zaangażowanych w wiązanie z proteazą, co pozwoli określić, w jaki sposób każda z oddziałujących reszt wpływa na interakcję cystatyny B z papainą. Kilka wariantów cystatyny B zostanie wytworzonych za pomocą mutogenezy celowanej.

W tego typu eksperymentach zawsze istnieje możliwość, że białka rekombinowane nie sfałdują się prawidłowo, ulegną agregacji lub degradacji, co prowadzi do błędnych i nieodtwarzalnych wyników. Urządzenie VIACORE X 100 umożliwia oznaczenie frakcji białka dostępnej do wiązania za pomocą analizy stężenia bez kalibracji, w skrócie CFCA. Podejście to pozwala na wyznaczenie stężenia białka z zachowaną aktywnością wiążącą nawet w sytuacjach, gdy standardy kalibracyjne są niedostępne.

Metoda CFCA zostanie tutaj wykorzystana do oznaczenia stężenia wariantów cystatyny B. Dane te posłużą następnie jako dane wejściowe do wyznaczenia kinetyki wiązania wariantów cystatyny B do Pepiny, co również jest oceniane przy użyciu BOR X 100. Cześć, nazywam się CLA gram z GE Healthcare w Szwecji.

Dzisiaj moja koleżanka Eva Pool pokaże Państwu, jak przeprowadzić analizę zależności struktura-funkcja przy użyciu BOR X 100. Białka rekombinowane mogą wykazywać nieprawidłowe fałdowanie lub utratę aktywności z upływem czasu, a zjawisko to nie może zostać wykryte metodami opartymi na pomiarze całkowitego stężenia. Może to w efekcie prowadzić do uzyskania błędnych danych kinetycznych po pomiarach stężenia za pomocą analizy stężenia bez kalibracji. B.A core X 100 jest wykorzystywany do analizy kinetyki i powinowactwa oddziaływania wariantów cystatyny B z pepsyną.

Parametry te pozwolą na zrozumienie mechanizmu wiązania. Rozpoczniemy od krótkiego wyjaśnienia projektu eksperymentalnego, zatem przejdźmy do szczegółów. Interakcja między cysteinową proteazą papainą a inhibitorem cystatyną B jest zdominowana przez kontakty hydrofobowe, co wynika z analizy struktury krystalicznej kompleksu obu białek.

Z perspektywy inhibitora obszarami kontaktu są reszty N i C-terminalne oraz dwie pętle spinki do włosów. W niniejszym badaniu przeanalizowano cztery mutanty, z których każdy zawiera mutację cysteiny na serynę, wprowadzoną w celu zapobiegania dimeryzacji cystatyny B. W oparciu o kontekst ujawniony w strukturze krystalicznej, leucynę 73 zmutowano na glicynę, histydynę 75 na glicynę, a tyrozynę 97 zmieniono na alaninę. Dwie mutacje na glicynę wprowadzono, aby zbadać znaczenie łańcuchów bocznych histydyny 75 i leucyny 73 dla wiązania z Pepsiną; resztę tyrozyny zmutowano na alaninę, aby zbadać oddziaływanie między C-końcem cystatyny B a Pepsiną.

Trzy mutanty podwójne, a także mutant pojedynczy INE three to Syrian, są badane pod kątem ich oddziaływania z katalitycznie nieaktywnym wariantem papainy S-metylo-papainy. Ta katalitycznie nieaktywna forma proteazy posiada grupę metylową przyłączoną do CYS 25 w szczelinie aktywnej. Dla uproszczenia, w całym protokole będziemy nazywać ten wariant propanem.

Metoda CFCA opiera się na pomiarze szybkości wiązania w warunkach, w których szybkość ta jest ograniczona dyfuzją cząsteczek analitycznych do powierzchni. Sprzyja temu wysoki poziom unieruchomienia ligandu. Przed rozpoczęciem procedury unieruchamiania, należy umieścić bufor HEPs używany w eksperymentach na lewej tacy i włożyć obie rurki.

Na prawej tacy należy również ustawić pustą butelkę na odpady. Następnie należy włożyć do instrumentu nowy czujnik gipsowy pięć, zainicjalizować go za pomocą oprogramowania core X 100, a na ekranie startowym kliknąć element dock chip tool. W oprogramowaniu należy kliknąć start doc.

Następnie, aby skonfigurować przygotowanie powierzchni i unieruchomienie poprzez sprzęganie aminowe do sensora CM5, należy użyć kreatora unieruchamiania: z ekranu startowego kliknij przycisk innych opcji, a następnie wybierz kreatory. Spowoduje to wyświetlenie okna z dostępnymi kreatorami. Wybierz unieruchamianie, a następnie kliknij przycisk nowa w prawym dolnym rogu. Pojawi się pierwszy ekran kreatora unieruchamiania, na którym domyślnie wybrana jest opcja sprzęgania aminowego do sensora CM5.

Zaznacz pole pod komorą przepływową dwa, aby przeprowadzić unieruchomienie w komorze przepływowej dwa. Komora przepływowa jeden pozostaje niemodyfikowana, aby służyła jako powierzchnia referencyjna spośród trzech dostępnych poniżej opcji. Zaznacz pole określ czas kontaktu, aby prawy poziom celu zmienił się na czas kontaktu, a następnie określ czas kontaktu wynoszący 900 seconds.

Następnie wprowadź parametry unieruchamiania w sekcji roztwór cząsteczki wychwytującej/liganda. Wpisz papaina. Następnie kliknij dalej.

Na następnym ekranie wyświetlany jest układ racka na próbki. Pozycja pierwsza będzie przeznaczona na etanolaminę, służącą do dezaktywacji pozostałych grup aktywnych po sprzężeniu liganda papainy z powierzchnią chipa. Wprowadź roztwór etanolaminy w pozycji pierwszej i drugiej.

Przygotować ligand papainę; papaina jest przechowywana w nadmiarze siarczanu metylu i rozcieńczona do stężenia 50 µg/mL w buforze octanu sodu 10 mM o pH 4,5. Rekonstytuować odczynniki sprzęgające EDC i NHS z zestawu do sprzęgania amin z wodą dwukrotnie destylowaną. Pipetować 85 µL EDC do fiolki. Zamknąć ją i umieścić w pozycji trzy.

Użyj takiej samej objętości NHS w pozycji czwartej. Należy pamiętać, że fiolka pięć powinna być zakapturkowana i pusta, aby instrument mógł wymieszać ED, C oraz NHS w tej fiolce. Należy również pamiętać o napełnieniu fiolki do płukania w pozycji H2O świeżą wodą dejonizowaną.

Po wypełnieniu statywu zgodnie z schematem wyświetlonym na ekranie, należy kliknąć ładuj próbki i włożyć statyw do instrumentu. Po załadowaniu statywu należy kliknąć dalej. Przed rozpoczęciem analizy wyświetlana jest lista kontrolna.

Należy upewnić się, że wszystkie punkty listy zostały zrealizowane. Pomiar rozpoczyna się po naciśnięciu przycisku start. Pomiar jest uruchamiany w trakcie procedury unieruchamiania.

Dane są zbierane w czasie rzeczywistym. Najpierw wstrzykuje się odczynniki sprzęgające. Następnie przeprowadza się sprzęganie peptydu z powierzchnią chipa, a procedurę kończy dezaktywacja pozostałych estrów aktywnych.

Po zakończeniu procesu w oknie dialogowym wyświetlane jest podsumowanie wyniku. W oknie tym wskazany jest poziom immobilizacji. Cała procedura sprzęgania powinna skutkować immobilizacją około 3000 RU papainy.

Po unieruchomieniu papainy na chipie sensorycznym należy rozpocząć analizę CFCA od rozcieńczenia próbek zmutowanej cystatyny B do stężenia całkowitego wynoszącego około 10 nanomolar w objętości co najmniej 300 mikrolitrów. Należy zapisać czynnik rozcieńczenia, ponieważ zostanie on wykorzystany później w konfiguracji testu. Rozpocznij od uruchomienia okna kreatora, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji, w części dotyczącej stężenia w folderze testu.

Wybierz opcję „calibration free”, a następnie wybierz „new”. Pierwszy ekran kreatora wyświetla sekwencję wtryskiwania. Ustawienia mogą pozostać niezmienione, ponieważ w tym przypadku zastosowano chip sensorowy CM5 oraz metodę bezpośredniej immobilizacji.

Na następnym ekranie kliknij „dalej”. Pozostaw zaznaczone pola wyboru „prime before run” oraz „run startup cycles”. Pozostaw również domyślną liczbę cykli rozruchowych ustawioną na trzy.

W polu nazwy roztworu wpisz heaps buffer. Następnie kliknij Dalej. Na następnym ekranie wpisz nazwę roztworu regenerującego, którym jest 20 millimolar sodium hydroxide.

Pozostałe parametry pozostaw bez zmian. Kliknij „dalej”, aby wyświetlić tabelę próbek. Przygotuj próbki zgodnie z tabelą próbek.

Każdy wiersz w tabeli próbek skutkuje dwoma cyklami. Jeden z przepływem 10 microliters per minute i jeden z przepływem 100 microliters per minute. Uruchom pomiar, zaczynając od próbki ślepej.

Następnie należy wprowadzić nazwę, czynnik rozcieńczenia, współczynnik dyfuzji w temperaturze 20 °C oraz masę cząsteczkową. Dla każdego mutanta współczynnik dyfuzji można obliczyć za pomocą narzędzia internetowego dostępnego na stronie produktu. Link do tego narzędzia znajduje się w nawigacji wsparcia oprogramowania.

Z uwagi na zalecenie, aby każdą próbkę analizować w powtórzeniu, skopiuj całą tabelę od wiersza pustego do ostatniej próbki i wklej ją na dole tabeli. Kliknij Dalej, aby kontynuować. Na następnym ekranie wyświetli się statyw na próbki.

Umieść próbki i odczynniki w statywie zgodnie z układem wskazanym przez oprogramowanie. Wprowadź statyw do urządzenia, naciskając przycisk ładowania próbek. Następnie kliknij dalej.

Po załadowaniu próbek wyświetlany jest ekran przypominający z listą kontrolną. Należy upewnić się, że wszystkie punkty zostały odznaczone, a następnie nacisnąć start. Dane są zbierane w czasie rzeczywistym podczas przebiegu analizy.

Po zakończeniu pomiaru zamknij okno wyświetlające zebrane dane. Zauważ, że w głównym oknie pojawił się nowy element wyniku. Aby obliczyć stężenia na podstawie danych, zaznacz nowy element wyniku i kliknij przycisk.

Przeprowadź ocenę za pomocą core X 100. Po uruchomieniu oprogramowania do oceny, wyświetlając wszystkie zebrane dane z paska narzędzi, wybierz analizę stężenia (concentration analysis), a następnie kalibrację bezwzględną (calibration free) z menu. W pierwszym oknie wybierz dane, które mają zostać uwzględnione w analizie.

Przewiń listę i przejdź przez listę widoku, aby wyświetlić dane dla wszystkich próbek. Jeśli chcesz wykluczyć jakiekolwiek dane, odznacz odpowiednie pole na liście. Kliknij „dalej”, aby rozpocząć obliczenia.

Model oddziaływań CFCA jest automatycznie dopasowywany do danych eksperymentalnych; po zakończeniu dopasowania wyniki dla każdej próbki są wyświetlane w oknie wyników. Przeglądaj dopasowania dla poszczególnych próbek, wybierając odpowiedni wiersz w tabeli. Kolumna o nazwie zmierzone stężenie wskazuje stężenie w analizowanej próbce.

Stężenie w oryginalnej próbce jest obliczane przy użyciu wcześniej wprowadzonego współczynnika rozcieńczenia i wyświetlane w kolumnie stężenia obliczonego; po zakończeniu należy kliknąć przycisk finish, aby zapisać wynik. Znając stężenia białek z analizy CFCA, mamy doskonałą podstawę do przeprowadzenia kolejnych pomiarów kinetycznych. Analiza kinetyczna pomoże nam teraz zrozumieć znaczenie kluczowych reszt aminokwasowych dla mechanizmu wiązania.

Rozpocznijmy od konfiguracji analizy kinetycznej. Analiza kinetyczna zaczyna się od zamontowania nowego chipa sensorycznego CM5 w urządzeniu na ekranie startowym. Wybierz opcję utworzenia przepływu pracy badania (assay workflow) dla powinowactwa kinetycznego.

W lewym górnym rogu pojawia się okno dialogowe, w którym wprowadzane są informacje o ligandzie. W polu nazwy liganda wpisz papain, a następnie wybierz inne białko z listy gatunków. Następnie, z dwóch przedstawionych alternatywnych metod przyłączania liganda, wybierz immobilize ligand covalently using sensor chip CM five; po prawej stronie okna zostanie teraz wyświetlony zalecany schemat analizy.

Proces rozpoczyna się od etapu unieruchomienia, po którym następuje etap analizy. Naciśnij kontynuuj, aby przejść dalej. Zapisz schemat analizy zgodnie z prośbą, wpisując nazwę i naciskając zapisz.

Oprogramowanie przedstawia teraz przebieg analizy, z przyciskami przypisanymi do każdego kroku. Pierwszym etapem w ramach przygotowania powierzchni sensora jest wyznaczenie pH mobilizacji. Ponieważ wartość pH jest znana, w pojawiającym się oknie dialogowym należy wybrać opcję wprowadź znaną wartość.

Wprowadź nazwę buforu acetate oraz pH 4.5 i wybierz zapisz. Przepływ analizy został teraz zaktualizowany o zielony znacznik wyboru, co wskazuje na zakończenie tego kroku. Teraz nadszedł czas na immobilizację; naciśnij przycisk run w kroku immobilized.

Wyświetla to ten sam kreator, który był używany do propanu i immobilizacji w analizie CFCA. Immobilizacja papiny do analizy kinetycznej jest tutaj skonfigurowana w ten sam sposób, z wyjątkiem tego, że wstrzykiwany jest bardziej rozcieńczony roztwór przez krótszy czas. Ma to na celu immobilizację mniejszej ilości papiny, aby uniknąć sytuacji, w których szybkości wiązania mutantów cystatyny są ograniczone dyfuzją, co pozwala na pomiar danych kinetycznych w izolacji. Ponieważ nazwa ligandu oraz pH immobilizacji zostały wprowadzone w poprzednich krokach procesu analizy, obie te wartości są tutaj ustawione domyślnie.

Jedyną wymaganą aktualizacją jest skrócenie czasu kontaktu do 50 seconds. Następnie immobilizacja przebiega zgodnie z wcześniejszym opisem. Oczekiwany poziom wiązania po immobilizacji wynosi 50 R ru.

Zielony znacznik wyboru obok przycisku uruchamiania oznacza, że immobilizacja została zakończona. Następnie w odpowiednim kroku przepływu pracy należy wprowadzić roztwór regenerujący. Warunki regeneracji można znaleźć, klikając opcję wprowadź znane wartości w wyświetlanym oknie dialogowym.

Wprowadź roztwór regenerujący oraz czas kontaktu, a następnie kliknij zapisz. Po unieruchomieniu ligandu i wprowadzeniu warunków regeneracji wszystko jest gotowe do wygenerowania danych kinetycznych. W polu Run Kinetics Affinity Assay naciśnij przycisk Run, aby rozpocząć pierwszy etap analizy kinetycznej.

Kreator powinowactwa przedstawia sekwencję wtrysków dla każdego cyklu w przypadku kinetyki pojedynczego cyklu, która jest tutaj zastosowana, więc nie ma potrzeby wprowadzania zmian. Kliknij Dalej, aby kontynuować. W następnym kroku zachowaj ustawienia domyślne wskazujące na przygotowanie systemu (priming) przed uruchomieniem.

Wybierz uruchomienie jednego cyklu startowego w celu wyrównania powierzchni chipa. Następnie zdefiniuj parametry wtrysku dla próbki. Ponieważ roztwór regenerujący został określony wcześniej i ustawienie jest zdefiniowane, nie ma potrzeby zmiany żadnego z parametrów na ekranie.

Kliknij dalej. Na koniec określ próbki. Wprowadź dwa wiersze dla każdego wariantu mutanta: jeden dla próby ślepej i drugi dla próbki.

Cykl pusty (blank) określa się poprzez ustawienie parametru najwyższego stężenia na zero. W każdym przebiegu można dopasować dwa warianty cystatyny B. Dla każdego mutanta należy wprowadzić masę cząsteczkową, najwyższe stężenie oraz czynnik rozcieńczenia, a następnie nacisnąć przycisk „dalej”.

Na następnym ekranie zaznaczono statyw na próbki. Przygotuj szereg rozcieńczeń próbek białek i umieść zakręcone fiolki w statywie. Zgodnie z instrukcją na ekranie, w pozycji 13 należy umieścić fiolkę z buforem, a w pozycji 14 fiolkę z roztworem regenerującym. Upewnij się, że pozycja na wodę została wypełniona świeżą wodą.

Umieść statyw w urządzeniu i załaduj próbki, naciskając przycisk ładowania próbek, a następnie kliknij „dalej”. Podobnie jak wcześniej, przed rozpoczęciem eksperymentu przeprowadź końcową weryfikację, naciskając „start”; dane z interakcji będą pojawiać się w czasie rzeczywistym. Po zakończeniu pomiaru niezwłocznie przystąp do analizy pozostałych wariantów cystatyny B, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Jeśli pozostałe warianty cystatyny B są analizowane jeden po drugim, należy pominąć etap przygotowania (prime) oraz cykl startowy, odznaczając odpowiednie pola wyboru w kroku. Po zakończeniu każdego przebiegu dane będą dostępne pod linkiem. Wszystkie wyniki znajdują się w przepływie pracy analizy.

Pojawi się okno dialogowe ze wszystkimi wynikami wygenerowanymi w ramach tego procesu. Aby obliczyć stałe szybkości kinetycznej, należy wybrać wynik do oceny i nacisnąć przycisk evaluate; zostanie wówczas ponownie uruchomione oprogramowanie do oceny core X 100, wyświetlające wszystkie zgromadzone dane. Z menu paska narzędzi należy wybrać opcję kinetics affinity.

Na pierwszym ekranie do oceny wybrano mutant cysteiny trzy do seryny. Dane dla tego mutanta są wyświetlane wraz z pomiarem tła wykonanym dla tego mutanta; aby przejść dalej, należy kliknąć przycisk Next. Na następnym ekranie prezentowane są dane po odjęciu pomiaru tła od pomiaru z próbką.

Wybierz opcję oceny kinetyki, klikając przycisk kinetics. Następnie wybierz dopasowanie danych do modelu oddziaływań jeden do jednego. Po kliknięciu przycisku fit, dopasowanie będzie wyświetlane na ekranie w miarę jego obliczania.

Po zakończeniu procesu automatycznie stosowane i wyróżniane na dole są kontrole jakości. Przejrzyj elementy kontroli jakości, a następnie sprawdź dane z sensogramów, aby upewnić się, że wykazują one wystarczające zakrzywienie. Przyjrzyj się również wykresowi rezyduów, który przedstawia różnice między zebranymi danymi a dopasowanym modelem.

Należy zwrócić uwagę na systematyczne i nierandomowe odchylenia. To dopasowanie jest dopuszczalne. Teraz przejrzyj dane kinetyczne w zakładce raportu.

Stała szybkości asocjacji, stała szybkości dysocjacji oraz równowagowa stała dysocjacji. Po zakończeniu naciśnij przycisk finish i powtórz tę samą procedurę dla wszystkich pozostałych mutantów. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy CFCA dla badanych wariantów cystatyny B.

Dane dotyczące stężenia wiązania swoistego są wyodrębniane z sensorgramów uzyskanych przy szybkościach przepływu 10 oraz 100 µL/min. Porównując stężenie wyznaczone za pomocą pomiaru two 80 ze stężeniem określonym metodą CFCA, widać wyraźnie, że podczas gdy w większości przypadków białko jest w pełni aktywne, w przypadku wariantu leucine 73 glycine frakcja aktywnego białka jest bardzo niska. Kinetykę wiązania wariantów cystatyny B do pepsyny wyznacza się z wykorzystaniem kinetyki jednocyklowej.

Sensorgramy przedstawiają dane po odjęciu sygnału z kanału pustego i referencyjnego, z nałożonymi na czarno krzywymi kinetyki dla modelu oddziaływania jeden do jednego. Stężenie wiązania specyficznego zmierzone metodą CFCA dla wariantu leucyny 73 stanowi jedynie około 10% całkowitego stężenia białka określonego w pomiarze two 80. Przy zastosowaniu poprawnego stężenia do obliczenia parametrów kinetycznych staje się jasne, że szybkość asocjacji dla leucyny 73 jest zbliżona do szybkości asocjacji pozostałych wariantów.

Podczas gdy szybkości asocjacji mutantów są porównywalne z szybkością białka typu dzikiego, stała szybkości dysocjacji mutantów może być wyższa niemal o dwa rzędy wielkości, z odpowiadającym temu wzrostem stałej dysocjacji równowagowej. Zmniejszone powinowactwo zależy głównie od zwiększonych szybkości dysocjacji, co wskazuje, że zarówno druga pętla wiążąca, jak i koniec C-terminalny cystatyny B przyczyniają się do powinowactwa wiązania poprzez utrzymanie inhibitora przyłączonego do enzymu po utworzeniu kompleksu. Zastosowanie analizy stężenia bez kalibracji było niezbędne do wyciągnięcia tego wniosku, ponieważ jeden z mutantów okazał się mieć bardzo niską aktywność wiązania. Mój kolega Pol pokazał Państwu, jak używać BiCore X100 w ustrukturyzowanym badaniu funkcji. Przeprowadzając te eksperymenty, należy pamiętać, że mimo iż zarówno analiza stężenia, jak i analiza kinetyczna opierają się na tej samej procedurze wiązania, warunki eksperymentalne są zupełnie inne.