Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest charakterystyka dużych kompleksów białkowych przy użyciu strukturalnej spektrometrii mas. Jest to osiągane poprzez przygotowanie kapilar powlekanych złotem do nanprzepływowej jonizacji elektronicznej (ESI). W drugim kroku przygotowywana jest próbka, a spektrometr mas jest kalibrowany do pomiarów wysokich mas.

Następnie optymalizuje się warunki eksperymentalne, aby zachować kompleksy białkowe w stanie nienaruszonym w fazie gazowej. Następnie rejestrowane są widma MS oraz tandemowe MS. Widma MS wykazały stany ładunku odpowiadające masie nienaruszonego kompleksu, natomiast eksperymenty tandemowego MS pozwoliły określić wzorzec asocjacji monomerów i kompleksów pozbawionych ligandów.

Cześć, jestem Naam Kiba z Laboratorium Mirona w Instytucie Nauki Whitemana, a ja jestem Isaac Ky. Ja również pochodzę z laboratorium michelon. Dzisiaj chcielibyśmy zaprezentować podstawową procedurę analizy dużych kompleksów białkowych z zastosowaniem spektrometrii strukturalnej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do charakteryzacji kompleksów białkowych w celu określenia ich geometrii, składu oraz sieci oddziaływań. Zapraszam do oglądania.

Analiza kompleksów białkowych związanych w sposób nieprądowy jest przeprowadzana techniką immunizacji przez rozpylanie powietrzne z wykorzystaniem kapilar as emme plus lub a qua. Kapilarę C można wyciągnąć do uzyskania cienkiej końcówki o średnicy około 1 µm, a następnie pokryć materiałem przewodzącym, takim jak złoto. Kapilary te są dostępne w sprzedaży, co można zobaczyć tutaj.

Jest to jednak rozwiązanie znacznie bardziej opłacalne. Kapilary szklane, które mogą zostać schłodzone i pokryte warstwą w celu przygotowania do użycia, są schładzane za pomocą tego urządzenia do chłodzenia igieł oraz pokrywane za pomocą tego urządzenia do powlekania. Aby rozpocząć procedurę, przyklej dwa paski dwustronnej taśmy klejącej do dna szalki Petriego, zachowując odstęp 2 cm między paskami.

Umieść pręcik szklany na środku jednej z podkładek. Podkładka adhezyjna utrzymuje kapilary w miejscu, a pręcik szklany podtrzymuje przygotowane kapilary i chroni ich końcówki przed złamaniem. Użyto kapilar z borokrzemianowego szkła o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,78 mm.

Włóż jedną kapilarę do igły, delikatnie przymocuj ją zaciskiem i wyreguluj jej położenie tak, aby znajdowała się w centrum drucika grzejnego. Delikatnie dokręć zaciski, aż kapilara zostanie stabilnie unieruchomiona z obu końców. Wyciągnij kapilarę, korzystając z zdefiniowanego programu przedstawionego tutaj.

Należy jednak pamiętać, że proces programowania wyciągarki opiera się na metodzie prób i błędów. Do momentu uzyskania odpowiedniego kształtu końcówki, każda wyciągnięta kapilara daje dwie gotowe kapilary o określonym kształcie. Wyjmij wyciągnięte kapilary z urządzenia i sprawdź końcówki, odrzucając wszystkie zdeformowane lub uszkodzone.

Użyj pęsety pozycjonującej z tępymi końcami, aby umieścić kapilary w szalce Petriego. Podstawa kapilar powinna być przytwierdzona do podkładki adhezyjnej, a górna część powinna opierać się o prętek szklany, z końcem skierowanym do góry. Kontynuuj układanie kapilar, aż szalka Petriego zostanie całkowicie wypełniona.

W naczyniu o średnicy 10 centymetrów mieści się około 80 kapilar. Następnie pokryj kapilary złotem. Włóż płytkę do napylacza złota.

Należy upewnić się, że zasilanie gazem zostało wybrane zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie uruchomić zdefiniowany cykl powlekania. Proces powlekania powtarza się od trzech do sześciu razy, aż kapilary uzyskają równomierny złoty kolor. Po przygotowaniu kapilar należy przystąpić do kalibracji spektrometru mas.

Większość eksperymentów przeprowadzanych na kompleksach MultiPro wykonuje się przy użyciu spektrometru mas czasu przelotu z kwadruplem i jonizacją rozpylną (Electrospray quadruple time of flight mass spectrometer), takiego jak ten. Wprowadzenie próbek odbywa się za pomocą układu firmy Waters, który został zmodyfikowany dla wysokich mas. Przed załadowaniem próbki białka należy skalibrować spektrometr mas przy użyciu jodku cezu.

W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór cezu o stężeniu 100 mg/mL w wodzie oczyszczonej. Cez służy do kalibracji wysokich mas, ponieważ jednowartościowe klastry soli obejmują szeroki zakres stosunku masy do ładunku, od 393 do ponad 10 000. Używając pęsety o tępym zakończeniu, należy wyjąć powlekaną kapilarę z szalki Petriego i nabić do niej 2 µL roztworu cezu.

Używając końcówki załadowanej żelem einor. Przesuń roztwór w stronę końcówki kapilary, ręcznie lub za pomocą adaptera do wirowania. Włóż kapilarę do uchwytu kapilarnego i ustaw ją w taki sposób, aby końcówka znajdowała się około 10 milimetrów od krawędzi uchwytu.

Umieść kapilarę pod mikroskopem optycznym i za pomocą ostrych pęsety typu AA przytnij jej końcówkę. Należy upewnić się, że wewnątrz kapilary nie znajdują się pęcherzyki powietrza, które mogłyby zablokować przepływ, oraz że kapilara nie jest zapchana. Ponadto upewnij się, że powłoka złota nie została zdjęta z kapilary.

Jeśli tak, należy wymienić kapilarę lub przyciąć jej końcówkę i usunąć niepowlekaną sekcję. Następnie podłącz uchwyt kapilary do interfejsu nano flow ESI. Przesuń stół XY, Z do tyłu, aby uniknąć uszkodzenia kapilary, a następnie wprowadź stół do pozycji aktywnej.

Kapilarę należy umieścić w odległości od 1 do 10 milimetrów od otworu stożka. Należy przyłożyć napięcie kapilarne i niskie ciśnienie przepływu nano do momentu zainicjowania rozpylania. Następnie należy spróbować zredukować ciśnienie przepływu nano do wartości minimalnej.

Zoptymalizuj intensywność sygnału poprzez dostrojenie położenia stolika XYZ, napięcia kapilarnego, ciśnienia nanostrumienia oraz przepływu gazu desolwatacyjnego. Aby wykryć szeroki zakres mas serii pików sezonowych, należy zoptymalizować napięcia przyspieszające. Parametry zastosowane w tym przypadku to: kapilara 1,3 do 1,7 kilowolta, stożek próbkowy 80 do 150 wolta oraz stożek ekstrakcyjny 1 do 3 wolta w celu optymalizacji transmisji jonów o wysokiej masie, które wymagają łagodnych warunków desolwatacji.

W początkowej fazie próżni pomiędzy źródłem a analizatorem ciśnienie podtrzymujące jest podnoszone do poziomu od pięciu do sześciu milibarów. Aby zwiększyć ciśnienie podtrzymujące, należy ostrożnie zmniejszyć przewodność linii próżniowej źródła do pompy spiralnej poprzez częściowe zamknięcie zaworu odcinającego, monitorując jednocześnie wpływ tego działania na intensywność sygnału. Po zakończeniu konfiguracji spektrometrów mas należy zebrać około 30 skanów z częstotliwością jednego skanu na sekundę w zakresie stosunku masy do ładunku od 1000 do 15 000; po akwizycji należy skalibrować czas przelotu, korzystając z odpowiedniej tabeli kalibracyjnej.

Po zakończeniu kalibracji można wprowadzić próbkę białka. Próbka jest przygotowywana przed kalibracją spektrometru mas; wymagane są niskie stężenia mikromolarne. W razie potrzeby zagęść próbkę, korzystając z urządzeń do ultrafiltracji odśrodkowej.

Przed użyciem należy zweryfikować, czy kompleks białkowy nie uległ adsorpcji do membrany urządzenia. Ze względu na sprawdzanie objętości i absorbancji UV, w technice NESI można stosować wyłącznie roztwory lotne, co często sprawia, że niezbędna jest wymiana buforu. W celu usunięcia wszelkich śladów soli, cząsteczek buforu lub innych nielotnych adduktów można zastosować mikrocentryfużową kolumnę do filtracji żelowej.

Zamiast tego zawiesić próbkę w wodnym roztworze octanu amonu. Ten krytyczny krok determinuje jakość widm.

Powtórz wymianę buforu do trzech razy przy minimalnym rozcieńczeniu, poniżej współczynnika 1,3 na urządzenie, aż do osiągnięcia maksymalnej wymiany. Jeśli wymagana jest zarówno koncentracja, jak i wymiana buforu, można je przeprowadzić jednocześnie, stosując ultrafiltrację odśrodkową, jak pokazano na początku tej sekcji. Następnie załaduj próbkę zgodnie z opisem dla kalibracji jodkiem cezu i uruchom rozpylanie.

Rozpocznij od wstępnej optymalizacji rozpylania do momentu wykrycia sygnału. Skorzystaj z przedstawionego równania na średni stan naładowania, w którym M oznacza masę kompleksu. Wartości w Daltonach, a dokładniej precyzyjna pozycja stanów naładowania, są jednak zależne od białka.

Aby zapobiec dysocjacji kompleksu, nie należy podgrzewać źródła żelaza. Należy wyłączyć grzałkę lub utrzymywać temperaturę poniżej 40 °C. Należy zmieniać położenie kapilary oraz napięcia stożka próbkowania i ekstraktora.

Aby zmaksymalizować transmisję jonów żelaza, możliwym punktem wyjścia jest napięcie stożka (cone voltage) 100 V, napięcie stożka ekstrakcyjnego (extractor cone) 1 V oraz napięcie kapilary 1,5 kV. Należy sprawdzić wynikową zmianę w widmach. Parametry te należy zoptymalizować w połączeniu z ciśnieniem nanostrumienia, aby poprawić desolwatację i usunąć pozostałości wody oraz składników buforu.

Zwiększ napięcie polaryzujące i ciśnienie gazu w komórce kolizyjnej. Typowe napięcia polaryzujące mieszczą się w zakresie od 10 do 100 V przy przepływie gazu w pułapce od 1 do 10 mL/min. Należy przeprowadzić tę czynność ostrożnie, aby zapobiec dysocjacji kompleksu, a następnie dostosować energie kolizyjne pułapki i transferu.

Do transmisji jonów o wysokiej masie często wymagane są wyższe napięcia, zazwyczaj w zakresie od 10 do 30 V. W tym punkcie ważne jest unikanie dysocjacji kompleksu indukowanej kolizyjnie, jak pokazano tutaj. Po uzyskaniu stabilnego sygnału zaleca się zmniejszenie ciśnienia nanostrumienia oraz napięcia kapilary do wartości minimalnych, przy jednoczesnym zachowaniu stabilnego rozpylania.

Po zgromadzeniu kilku skanów należy przystąpić do identyfikacji składników kompleksu za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Po uzyskaniu optymalnego i stabilnego sygnału dla kompleksu białkowego, należy wybrać jon prekursor i ustawić środek masy w szerokości izolacji. Zazwyczaj w przypadku niskiej rozdzielczości masy 12 oraz wysokiej rozdzielczości masy między 13 a 15 stosuje się szeroki zakres masy w celu wykrycia produktów dysocjacji o wysokiej masie i niskim ładunku, a następnie redukuje się go do wartości pożądanych w celu przeprowadzenia analizy ms.

Metoda MS dysocjuje prekursor żelaza. Poprzez zwiększenie energii kolizyjnej (w skrócie CE) oraz ciśnienia w komórce kolizyjnej, należy stopniowo zwiększać CE pułapki lub transferu w krokach od 10 do 20 V oraz podnieść ciśnienie gazu kolizyjnego do wartości od 0 do 5 ml/min. Należy monitorować zmiany w widmach aż do osiągnięcia optymalnych warunków aktywacji. Wysoka energia aktywacji może indukować dysocjację jednej lub większej liczby podjednostek z nienaruszonego kompleksu i pozwolić na wyjaśnienie powinowactw oddziaływań różnych podjednostek.

Wybierz więcej niż jeden ładunek do analizy ms MS. W przypadku nakładających się komponentów pozyskanie zestawu widm MS tandemowych pomaga w rozdzieleniu serii ładunków różnych populacji. Ponadto stany o wyższym ładunku dysocjują łatwiej niż stany o niższym ładunku; nałóż na siebie widma MS i ms.

Widma MS w celu walidacji izolacji wybranego jonu prekursorowego. Oprócz charakterystyki nienaruszonego kompleksu za pomocą MS i ms/MS, w łagodnych warunkach denaturujących w roztworze powstają mniejsze podkompleksy, które również poddano charakterystyce.

Analiza MS i ms MS podzespołów stanowi podstawę do zdefiniowania architektury podjednostek kompleksu. W celu częściowego zaburzenia oddziaływań między podjednostkami należy stopniowo dodawać rozpuszczalniki organiczne do stężenia 50% lub zmienić pH roztworu, dodając amoniak lub kwas mrówkowy do stężenia 4%. W końcu, aby określić masy poszczególnych podjednostek tworzących kompleks, ważne jest zarejestrowanie widma w warunkach denaturujących. Można to przeprowadzić przy użyciu zip tip C4 w stosunku wody do acetonitrylu od 25 do 75, stosując 1% kwas mrówkowy jako rozpuszczalnik elucyjny. Wszystkie zebrane dane należy przetworzyć i przeanalizować zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Przed wprowadzeniem próbki kompleksu białkowego spektrometry mas zostają skalibrowane przy użyciu jodku cezu.

Seria równomiernie rozmieszczonych piku zaznaczonych na czerwono rozciąga się w szerokim zakresie od głównego stosunku ładunku 393 do wartości znacznie przekraczającej 10 000. Przypisano je jednokrotnie naładowanym klastrom soli o ogólnym składzie kompleksu cezu na plus. Dodatkowe sygnały pomiędzy głównymi pikami, zaznaczone na czarno, są spowodowane obecnością gatunków dwu- i trzykrotnie naładowanych z serii kompleksów cezu na dwa plus oraz kompleksów cezu na trzy plus.

Zwiększenie ciśnienia na początkowym stopniu próżni jest niezbędne do wykrywania klastrów o wysokiej masie. Wpływ ciśnienia na piki wysokich mas zademonstrowano tutaj przy wartościach ciśnienia odczytanych jako 1,2 oraz 5,3 millibar. Widok powiększony widma masowego dla wyższego ciśnienia przedstawiono tutaj.

Poniżej przedstawiono przykład spektrometrii mas kompleksu wariantu lektyny, w której rozkład stanów ładunku mieści się w zakresie od 3000 do 5 000 m/z. Jednakże ze względu na niewystarczającą desolwatację jonów piki są szerokie. Zwiększenie napięcia polaryzującego z 4 V do 15 V, co prowadzi do nasilenia warunków przyspieszania, powoduje usunięcie pozostałych cząsteczek wody i składników buforu, co skutkuje uzyskaniem widma o wysokiej rozdzielczości; zmierzona masa odpowiada kompleksowi pentamerycznemu.

Następnie do analizy tandemowej MS wybrano stan naładowania +15. Zwiększenie energii kolizyjnej powoduje uwolnienie wysoko naładowanego monomeru z centrum przy stosunku masy do ładunku 1 664 oraz pozbawionego ligandów kompleksu tetramerycznego w zakresie stosunku masy do ładunku od 5 000 do 8 000. Kompleks wariantu lektyny zbadano również w warunkach denaturujących, co doprowadziło do asocjacji kompleksów.

W ten sposób można określić dokładną masę poszczególnych podjednostek tworzących kompleks. Przedstawiliśmy właśnie sposób pozyskiwania widm MS i MS/MS dla jonów o wysokiej masie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest prawidłowe przygotowanie próbki oraz stosowanie wyłącznie buforów lotnych, które są kompatybilne ze spektrometrią mas.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.