Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Komórki E Coli RP 4 37 są wprowadzane do urządzenia do chemotaksji, w którym są poddawane działaniu określonych przestrzennych gradientów stężeń. Komórki wnikające do komory napotykają punkt środkowy gradientu stężeń. W zależności od tego, czy sygnał jest odbierany jako atraktant, czy repelent, bakterie szybko przemieszczają się w górę lub w dół gradientu stężeń.

Witam, nazywam się Derek Engler i reprezentuję Laboratorium Biotechnologii Systemów Molekularnych oraz Katedrę Inżynierii Chemicznej na Texas A&M University. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę badającą chemotaksję bakteryjną w urządzeniu mikrofluidycznym. W naszych laboratoriach wykorzystujemy tę procedurę do badania sposobu, w jaki szczep E. coli RP 437 migruje w gradiencie stężeń siarczanu niklu.

Zacznijmy zatem. Warstwa fluidyczna i warstwa sterująca są wytwarzane metodą odlewania replikacyjnego polimetylosiloksanu (PDMS) z matrycy SU-8. Aby rozpocząć tę procedurę, wymieszaj prepolimer PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1.

Odgazuj mieszaninę w eksyكاته przez jedną godzinę, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Po przygotowaniu mieszaniny PDMS, umieść matrycę SU-8 w szalce Petriego i ostrożnie wlej mieszaninę na matrycę SU-8 do pożądanej grubości. Podgrzewaj szalkę Petriego zawierającą PDMS i formę matrycy SU-8 w temperaturze 80°C przez dwie godziny, aby utwardzić PDMS.

Po dwóch godzinach należy zdjąć utwardzony PDMS pokrywający matrycę SU-8 z płyty grzejnej i oddzielić formę z PDMS od matrycy SU-8. Pożądana struktura będzie zatopiona w formie z PDMS. Używając tępej igły o rozmiarze 20 G, należy wykonać w formie z PDMS cztery otwory na rurki prowadzące do generatora gradientu, wlotu i wylotu komórki. Teraz możemy przystąpić do montażu urządzenia z PDMS w celu jego zbondingowania.

Najpierw należy oczyścić szklany preparat do mikroskopu izopropanolem i osuszyć go za pomocą strumienia powietrza. Następnie formę z PDMS oraz szklany preparat należy poddać działaniu plazmy tlenowej w urządzeniu do trawienia plazmowego przez około 30 sekund. Po tym czasie należy docisnąć formę z PDMS do szklanego preparatu. Zestaw złożony z preparatu i formy z PDMS należy podgrzewać na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 15 minut.

Aby złożyć urządzenie PDMS, należy za pomocą żyletki odciąć rurkę pod kątem 45 stopni do odpowiedniej długości, zależnie od konfiguracji mikroskopu. Następnie, używając pęsety, należy włożyć jeden koniec rurki do jednego z czterech otworów wykonanych w urządzeniu.

W drugim końcu rurki umieść tępy kikut igły o rozmiarze 30 G. Powtórz czynność wstawiania rurki i kikuta igły we wszystkie pozostałe otwory. Do strzykawki o pojemności 3 ml nabierz 1 ml chemo taxes, buforu lub CB.

Należy zadbać o usunięcie powietrza ze strzykawki. Za pomocą pipety nanieść CB do nasadki igły wylotowej, a następnie opukać nasadkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Wypchnąć niewielką ilość CB z końcówki strzykawki o pojemności 3 ml i połączyć strzykawkę z nasadką igły, uważając, aby nie uwięzić powietrza.

Przeciśnij CB przez urządzenie, aż wszystkie pozostałe piasty igieł zostaną wypełnione CB. Powinno to usunąć większość pęcherzyków powietrza. Następnie napełnij dwie strzykawki o pojemności 500 µL CB zawierającym odpowiednie stężenia testowanego efektora chemicznego.

Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, wypchnij niewielką kroplę zawartości strzykawki, dotknij kroplą cieczy w piaście igły, a następnie podłącz strzykawkę, aby przygotować bakterie o wysokiej ruchliwości. Do eksperymentu z chemotaksją należy wyhodować kulturę nocną e coli RP 4 37 z plazmidem wykazującym ekspresję GFP w bulionie tryptonowym lub TB w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem. Następnego dnia wykorzystaj kulturę nocną do zaszczepienia 20 ml kultury TB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml do gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej około 0,05.

Hodowlę inkubować w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem, aż komórki osiągną OD 600 na poziomie około 0,35 do 0,45. Zebrać je poprzez wirowanie z niską prędkością, a następnie zawiesić komórki do OD 600 około 0,35 w buforze CB zawierającym efektor chemiczny w stężeniu przewidywanym w środkowej części kanału. Na koniec do żywych komórek ekspresyjących GFP dodać martwe komórki znakowane RFP o OD 600 około 0,35.

Martwe komórki te będą służyć jako kontrola wewnętrzna, aby upewnić się, że migracja nie wynika z efektów przepływu. Zawiesina komórkowa jest teraz gotowa do wprowadzenia do urządzenia mikrofluidycznego w celu przeprowadzenia eksperymentu z chemotaksją. Aby rozpocząć eksperyment z chemotaksją, należy usunąć część CB z piasty igły wlotowej dla komórek i uzupełnić ją zawiesiną komórkową.

Ostrożnie napełnij strzykawkę o pojemności 50 µL resuspensowanymi komórkami. Czynność tę należy wykonywać powoli, ponieważ flagella mogą ulec odcięciu, co zmniejszy ruchliwość. Podłącz strzykawkę 50 µL do gniazda igły wlotowej, tak jak pokazano wcześniej: wypchnij małą kroplę zawartości strzykawki, dotknij kropli do cieczy w gnieździe igły, a następnie przymocuj strzykawkę. Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w szybką kamerę do akwizycji obrazu.

Umieść obie strzykawki wlotowe w pompie strzykawkowej i uruchom przepływ w taki sposób, aby wytworzyć gradient i doprowadzić komórki do przepływu przez cewkę. Gdy komórki wpłyną do komory chemotaktycznej, odczekaj około 20 minut aż układ się ustabilizuje. Przed obrazowaniem wykonaj zdjęcia fluorescencyjne żywych komórek (zielonych) i martwych komórek (czerwonych) w różnych miejscach wzdłuż długości komory.

Zazwyczaj gromadzimy 100 obrazów w każdej lokalizacji w odstępach trzech sekund. Uzyskane obrazy fluorescencyjne można analizować za pomocą dowolnego dostępnego komercyjnie programu do analizy obrazu, takiego jak Image J lub metamorph, lub przy użyciu prostych kodów napisanych w MATLABie. W tym przykładzie wykorzystamy kody MATLAB.

Rozpocznij od usunięcia pikseli tła z obrazu poprzez ustawienie progowej intensywności pikseli i usunięcie wszystkich pikseli, których intensywność jest niższa od progu. Pozwala to zminimalizować szumy. W analizie wykorzystaj pozycję martwych komórek do wyznaczenia środka obrazu.

Reprezentuje to pozycję, w której komórki weszły do komory chemotaktycznej i w której byłyby wykryte w przypadku braku migracji. Następnie należy zlokalizować żywe komórki na obrazie, podzielić obraz na kanały i określić liczbę żywych komórek w każdym kanale. W naszych wcześniejszych pracach komora chemotaktyczna o szerokości 10 50 µm została podzielona na 64 kanały, z których każdy miał szerokość około 16 µm.

Po powtórzeniu tych kroków dla wszystkich obrazów, zsumuj całkowitą liczbę komórek dla każdego kanału we wszystkich obrazach. Pozwoli to uzyskać całkowitą liczbę komórek wykrytych w każdym kanale w trakcie trwania eksperymentu. Oblicz współczynnik chemotaktyczny, współczynnik podziału lub CPC, który reprezentuje kierunek migracji.

Wykonując następujące kroki, przypisz mnożnik plus jeden do każdej komórki znajdującej się po stronie wysokiego stężenia (prawej) oraz mnożnik minus jeden do każdej komórki po stronie niskiego stężenia (lewej) w odniesieniu do martwych komórek. Zsumuj wszystkie pomnożone wartości i znormalizuj je do całkowitej liczby wykrytych komórek. Oblicz współczynnik migracji chemotaktycznej (CMC), który określa migrację komórek w zależności od przebytego dystansu.

Komórka, która przemieści się do najdalejszej pozycji o wysokim stężeniu w kanale 64, otrzymuje wagę +1, natomiast komórka, która przemieści się w połowę w stronę wyższego stężenia, otrzymuje wagę +0,5. Przemieszczenie się do najdalejszej pozycji o niskim stężeniu jest ważone wartością -1. Suma wszystkich ważonych liczb komórek zostaje znormalizowana względem całkowitej liczby komórek w celu wygenerowania CMC.

Wykres ten przedstawia liniowy gradient lub profil stężeń utworzony w urządzeniu mikroprzepływowym z użyciem izotiocyjanianu fluoresceiny. Powstanie gradientu stężeń zostało zilustrowane na tej rycinie za pomocą niebieskiego i żółtego barwnika. Wlot komórkowy był zamknięty, tak aby nie występował przez niego przepływ; można zauważyć, że utworzył się zakres kolorów pośrednich między niebieskim a żółtym.

Poniższe obrazy w pseudokolorach pochodzą z reprezentatywnego eksperymentu chemotaktycznego, w którym szczep e coli RP 4 37 został poddany działaniu gradientu od 0 do 100 µM L-asparaginianu lub od 0 do 225 µM siarczanu niklu w urządzeniu. Migracja żywych zielonych bakterii w kierunku L-asparaginianu lub z dala od niklu była obrazowana co 2,5 sekundy przez 30 minut. Martwe bakterie, zaznaczone na czerwono, służyły jako kontrola efektów przepływu w urządzeniu.

Rozkład przestrzenny szczepu RP 4 37 w urządzeniu mikrofluidycznym w przypadku braku gradientu przedstawiono na tym wykresie w porównaniu z jego reakcją na gradient aspartanu oraz gradient siarczanu niklu. Właśnie pokazaliśmy, jak monitorować chemotaksję E. coli RP 4 37 w gradiencie siarczanu niklu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zminimalizować wirowanie komórek w wirówce z mieszadłem (vortexing), aby możliwe było wykorzystanie subpopulacji o wysokiej ruchliwości.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.