Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Nazywam się Jiang. Jestem stypendystą w ramach programu posterowego w Harvard and MIT Health, science and Technology. a ja nazywam się Amir Manchi i jestem studentem studiów licencjackich w laboratorium profesora ha SANE w Harvard, MIT, division of Health Sciences and Technology.

Ten slajd przedstawia schemat procesu wykonania urządzenia: najpierw na powierzchnię silikonu naniesiono warstwę SU-8 metodą spin coatingu, następnie na wierzch nałożono maskę, po czym przeprowadzono ekspozycję na promieniowanie UV i wywołanie. W ten sposób uzyskaliśmy elektrody na powierzchni silikonu. Następnie odlano PDMS, który po utwardzeniu i wypalaniu został poddany niewielkiemu przebiciu, a następnie złączono urządzenie z PDMS z podłożem szklanym za pomocą plazmy tlenowej.

Znajdujemy się teraz w pracowni mikrofabrykacji w laboratorium i zaczniemy od przygotowania warstw PDMS. Przez PDMS rozumiem polidimetylosiloksan, który jest polimerem organicznym. Jest to najszerzej stosowany organiczny polimer na bazie krzemu.

W rzeczywistości jest to mieszanina dwóch różnych składników: bazy elastomeru silikonowego oraz utwardzacza elastomeru silikonowego. Stosunek wynosi 10 części bazy do jednej części utwardzacza. Potrzebujemy około 10 g bazy, a zatem odpowiednio około 1 g utwardzacza elastomeru, który następnie spróbuję wymieszać z bazą tak, aby były one ze sobą zgodne.

Użyję pipet. Ponieważ mieszanina jest już gotowa, wyleję ją teraz na wafer krzemowy. Idea polega na tym, że wafry krzemowe mają na swojej powierzchni określone wzory.

Pomagają one polimerowi PDMS uzyskać odpowiedni wzór, a wzorów tych używamy do stworzenia kanałów, rowków lub dowolnego innego kształtu, którego potrzebujemy na tych polimerach. Kolejnym krokiem, ponieważ w mieszaninie znajduje się wiele pęcherzyków powietrza, będzie umieszczenie jej w próżni, aby wyeliminować te pęcherzyki z polimeru. Umieścię żele PDMS na waflu krzemowym wewnątrz komory próżniowej.

Zamknę komorę i włączę pompę próżniową. Po zniknięciu pęcherzyków powietrza, prawdopodobnie po około dwóch minutach, umieścimy próbkę w piekarniku na noc w temperaturze około 70°C, co spowoduje ich utwardzenie. Zwróćcie uwagę na ten wzór trzech różnych zbiorników, które służą do tworzenia gradientów, tak aby z jednej stronyy stężenie wynosiło zero, a z drugiej konkretną wartość, z równomiernym przejściem pomiędzy nimi; na przeciwległym końcu wykonamy mały otwór, który w tym przypadku będzie stanowił wylot.

Kolejnym krokiem jest wycięcie jednego z tych szablonów i przeniesienie go do szalki Petriego, tak aby powierzchnie szablonu były skierowane do góry. Mam nadzieję, że widzą Państwo trzy wloty i jeden wylot na tych szablonach, o których wcześniej wspomniałem. Do wykonania wlotów użyjemy małych wycinaków, aby móc zastosować rurki polietylenowe, natomiast do wylotu użyję dużych wycinaków, aby uzyskać rezerwuar.

Zaczniemy od pierwszego wlotu. Wykonam otwór, tak samo w przypadku drugiego wlotu, a także kolejny mały otwór dla trzeciego. Ostatnim krokiem jest wykonanie dużego otworu przy wylocie.

Gdy skończymy, otrzymamy warstwę PDMS, która będzie warstwą górną, a na dole zastosuję kolejną warstwę szkła. Te mikroprzedmioty szkiełka będą stanowiły warstwę dolną moich urządzeń mikrofluidycznych. Znajdujemy się teraz w pomieszczeniu do mikrofabrykacji; mam jedną warstwę szkła i jedną warstwę PDMS, które chcę do siebie przytwierdzić.

Obecnie wykorzystamy urządzenie nazywane oczyszczaczem plazmowym. Wewnątrz komory plazma pomoże w rozrywaniu słabych wiązań powierzchniowych i zastąpieniu ich grupami o wysokiej reaktywności chemicznej, a powierzchnia stanie się w rzeczywistości hydrofilowa. Teraz wezmę formę z PDMS, która stanowiła górną warstwę i posiadała wewnątrz kanały, oraz usunę taśmę, którą nakleiłem wcześniej, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na naszej formie.

Umieścę to wewnątrz komory. Następnym krokiem jest wykorzystanie warstwy szklanej, którą jest szkiełko przedmiotowe; będzie ona stanowić naszą dolną warstwę wewnątrz urządzenia. Zatem to również umieszczę wewnątrz komory.

Następnie całkowicie zamykam komorę. Po zamknięciu włączam najpierw zasilanie, a potem pompę; do urządzenia musimy wrócić za około pięć minut. To, co zrobię, to wyłączę maszynę. Zatem najpierw wyłączam pompę, następnie zasilanie i otwieram komorę.

Dźwięk ten wynika w rzeczywistości z podciśnienia, które zostało zastosowane wewnątrz komory podczas procesu. Wyjmę teraz poszczególne warstwy i chcę je ze sobą połączyć. Ponieważ warstwą spodnią jest szkło, będę trzymać je nieruchomo w lewej ręce, a następnie wezmę warstwę PDMS i położę ją na warstwie szklanej.

Ponieważ wzory są obecnie skierowane stroną górną, odwrócę warstwę PDMS. Umieszczę ją na szkle, dociskając obie powierzchnie do siebie. Bardzo łatwo się one łączą, a jedną z zalet procesu traktowania plazmą jest siła adhezji oraz trwałość połączenia.

Tak to wygląda na koniec. Zatem ponownie – tutaj znajdują się nasze wloty, a tutaj wylot i jesteśmy gotowi do przejścia do następnego kroku. Inkubacja wewnątrz urządzenia przez jedną godzinę, a następnie po godzinie wyjęcie próbki z inkubatora, dodanie pożywki do hodowli ryb i przygotowanie roztworu.

Aby przygotować roztwór EGF, do 2 mL pożywki hodowlanej dodajemy 15 ng EGF oraz 10 µM 5-FD, aby umożliwić wizualizację gradientu EGF w kanale. Następnie pobieramy 2 mL pożywki i wlewamy tutaj kolejne 2 mL pożywki. Te dwa ustawienia służą jedynie do zwykłej perfuzji pożywki hodowlanej w urządzeniu.

Zatem usuwam pęcherzyk powietrza, podłączam ponownie, ten mobilny pęcherzyk znowu opada. Następnie używam 15 ng EGF, 10 µM FITC-dekstranu oraz 2 ml pożywki z próbki nr 2, nakładam strzykawkę, a następnie usuwam pęcherzyk. Po czym następuje wymiana roztworu i powrót do poprzedniego.

Roztwór należy pobrać do strzykawki typu gazowego i kilkukrotnie nacisnąć tłok, aby usunąć pęcherzyki powietrza; najpierw należy doprowadzić roztwór do wszystkich przełączników strzykawki, a następnie przekręcić zawór, tak aby roztwór przepłynął przez zawór trójdrożny i cewkę, aż wypłynie on z jej końca. Po wymieszaniu, gdy roztwór wypłynie, można wprowadzić cewkę do urządzenia My Predict, upewniając się, że wszystkie trzy roztwory są identyczne. Następnie należy delikatnie podłączyć wlot kanału infuzyjnego.

Zatem w końcowym etapie mamy dwie próbki: pierwszą stanowi standardowa pożywka hodowlana, a drugą pożywka z dodatkiem EGF, co służy potwierdzeniu profilu gradientu EGF. Ta próbka zawiera komórki w sieci.

Będzie to wylot komórkowy, zatem gradient zostanie wytworzony przy użyciu trzech kanałów centralnych, a następnie gradient powstanie w obszarze komórkowym. Zazwyczaj w takim przypadku przeprowadzamy osadzanie komórek: zawiesinę komórkową wprowadza się do wylotu, a następnie delikatnie odsysamy zawartość sieci, dzięki czemu komórki przepływają przez obszar komórkowy, automatycznie osadzają się i przylegają do powłoki. Po upewnieniu się, że komórki całkowicie się rozprzestrzeniły, możemy rozpocząć infuzję i badać migrację komórek przy użyciu urządzenia do generowania gradientu.