Prosty system punktacji złożonego fenotypu do oceny modeli mysich ataksji móżdżkowej
21 maja 2010
Opisujemy protokół szybkiej i czułej kwantyfikacji stopnia nasilenia choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej. Pomiary obejmują kleszczenie kończyn tylnych, test krawędzi, chód oraz kifozę. Protokół ten skutecznie rozróżnia osobniki dotknięte chorobą od osobników zdrowych i pozwala wykryć postęp choroby u osobników dotkniętych w czasie.
Opracowaliśmy złożony system oceny fenotypowej do ewaluacji stopnia ciężkości oraz progresji choroby. W modelach mysich ataksji móżdżkowej wykonujemy cztery różne testy: test krawędzi (ledge test), ocenę kończyn tylnych, oceniającą clasping, chód oraz kifozę, stosując skalę od zera do trzech dla każdego z testów, co daje łączną punktację od 0 do 12. Wśród wszystkich czterech pomiarów test krawędzi służy do bezpośredniego pomiaru koordynacji.
Przykurcz kończyn tylnych jest markerem postępu choroby w wielu modelach mysich neurodegeneracji. Chód jest miarą koordynacji i funkcji mięśniowej. Kifoza to zakrzywienie kręgosłupa w odcinku szyjno-piersiowym, powszechne w modelach mysich neurodegeneracji układu ruchowego oraz rdzeniowo-móżdżkowej; dla każdego zwierzęcia należy przeprowadzić poszczególne testy i zapisać uzyskany wynik.
Dla każdej grupy myszy oblicza się średnią sumę czterech wyników lub średni wynik kompozytowy fenotypu, a następnie nanosi go na wykres. Przy stosowaniu tego protokołu w różnych modelach mysich ważne jest, aby najpierw przeanalizować wyniki poszczególnych testów w celu ustalenia optymalnej kombinacji czterech opisanych miar. Ten konkretny protokół został opracowany w celu odróżnienia osobników dotkniętych chorobą od zdrowych, a także ilościowego określenia postępu fenotypu choroby w modelach mysich rdzeniowej ataksji móżdżkowej.
Typ siódmy. Cześć, jestem Stephanie Fur z laboratorium dr Gwen Garden w Departamencie Neurologii na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Dzisiaj zaprezentujemy prostą i czułą metodę oceny ciężkości choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej.
Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu ilościowej oceny różnic fenotypowych w modelach mysich rdzeniowej ataksji móżdżkowej typu siedem lub SCA7 oraz w celu monitorowania progresji fenotypu SCA7 w czasie. Zacznijmy zatem. Test krawędziowy (ledge test) jest bezpośrednią miarą koordynacji, która jest zaburzona w ataksjach móżdżkowych i wielu innych schorzeniach neurodegeneracyjnych.
Służy to pomiarowi parametrów najbardziej bezpośrednio porównywalnych z ludzkimi objawami ataksji móżdżkowej, aby zapobiec błędowi systematycznemu. Osoba przeprowadzająca oceny nie powinna mieć wiedzy na temat genotypu zwierzęcia. Podczas ocen poszczególne wskaźniki są punktowane w skali od zera do trzech, gdzie zero oznacza brak fenotypu, a trzy jego najcięższą postać.
Zacznij od podniesienia myszy z klatki i umieszczenia jej na krawędzi klatki. Obserwuj mysz, gdy idzie wzdłuż krawędzi klatki i schodzi z powrotem do jej wnętrza. Myszy typu dzikiego będą iść wzdłuż krawędzi bez utraty równowagi i sprawnie zeskoczą z powrotem do klatki, wykorzystując swoje łapy.
Takie zachowanie otrzymuje ocenę zero. Jeśli mysz straci równowagę podczas chodzenia wzdłuż krawędzi, ale w pozostałych aspektach wydaje się skoordynowana, otrzymuje ocenę jeden. Jeśli nie potrafi efektywnie posługiwać się tylnymi kończynami lub nie jest w stanie płynnie zejść do klatki.
Próbkę ocenia się na dwa punkty, jeśli podczas chodzenia lub próby zejścia spadnie z krawędzi lub niemal z niej spadnie, albo jeśli drży i całkowicie odmawia ruchu. Pomimo zachęty, jeśli zwierzę nie reaguje, otrzymuje ocenę trzy. Test krawędzi należy przeprowadzić trzykrotnie, aby zapewnić dokładny pomiar, a następnie zapisać wynik testu krawędzi.
Przejdźmy teraz do oceny odruchu chwytnego kończyn tylnych. Chwytanie kończyn tylnych jest wskaźnikiem progresji choroby w wielu modelach mysich neurodegeneracji, w tym w przypadku niektórych ataksji móżdżkowych. Aby rozpocząć ocenę, chwyć ogon u nasady i unieś mysz, usuwając z otoczenia wszystkie zbędne przedmioty.
Obserwuj pozycję kończyn tylnych przez około 10 sekund. Jeśli kończyny tylne są stale rozstawione na zewnątrz, z dala od brzucha, przypisuje się ocenę zero. Jeśli jedna kończyna tylna jest przyciągnięta do brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, otrzymuje ona ocenę jeden.
Jeśli obie kończyny tylne są częściowo przyciągnięte do brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, przypisuje się wynik dwa. Jeśli kończyny tylne są całkowicie przyciągnięte i dotykają brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, przypisuje się wynik trzy. Test należy przeprowadzić trzykrotnie i zapisać wynik przyciągania kończyn tylnych.
Przejdźmy teraz do oceny chodu. Test chodu jest miarą koordynacji i funkcji mięśni. Aby rozpocząć test, należy wyjąć mysz z klatki i umieścić ją na płaskiej powierzchni głową skierowaną w stronę przeciwną do badacza.
Obserwuj mysz od tyłu podczas chodu. Jeśli mysz porusza się normalnie, ciężar ciała jest wsparty na wszystkich kończynach, brzuch nie dotyka podłoża, a obie kończyny tylne pracują równomiernie, przypisuje się ocenę zero. Jeśli występuje drżenie, mysz kuleje podczas chodzenia lub jej stopy są lekko skierowane na zewnątrz, przypisuje się ocenę jeden.
Jeśli występuje silny drżenie, silne utykanie, obniżenie miednicy lub stopy są bardziej odwrotne od osi ciała podczas lokomocji, przypisuje się ocenę dwa. Jeśli mysz ma trudności z poruszaniem się do przodu i ciągnie brzuchem po ziemi, otrzymuje ocenę trzy. Obserwuj GA myszy trzy razy i zapisz wynik oceny.
Przejdźmy teraz do testu kifozy. Kifoza to charakterystyczne wygięcie kręgosłupa w odcinku grzbietowym. Jest to powszechny objaw chorób neurodegeneracyjnych obejmujących układy ruchowe, w tym rdzeniowe i móżdżkowe ataksje w modelach mysich.
Jest ona spowodowana utratą napięcia mięśniowego w mięśniach grzbietu wtórnie do neurodegeneracji. Na początek wyjmij mysz z klatki i umieść ją na płaskiej powierzchni. Obserwuj zwierzę podczas chodzenia.
Jeśli mysz jest w stanie łatwo wyprostować kręgosłup podczas chodzenia i nie wykazuje utrwalonej kifozy, otrzymuje ocenę zero. Jeśli mysz wykazuje łagodną kifozę, ale jest w stanie wyprostować kręgosłup, otrzymuje ocenę jeden. Jeśli nie jest w stanie go wyprostować, robi to całkowicie i utrzymuje utrwaloną, lecz łagodną kifozę, otrzymuje ocenę dwa.
Jeśli mysz utrzymuje wyraźną kifozę podczas chodzenia lub siedzenia, przypisuje się jej ocenę trzy. Należy trzykrotnie ocenić stopień kifozy u myszy. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce i zapisz uzyskaną ocenę kifozy.
Oto reprezentatywny wykres złożonej oceny fenotypu mysiego modelu transgenicznego ataksji móżdżkowej typu siedem, znanego jako Flocked SCA 7 92 Q. Wyniki czterech pomiarów zostały zsumowane dla każdej myszy, a następnie obliczono średni wynik złożony dla obu genotypów w każdym wieku. Myszy Flocked SCA 7 92 Q wykazują progresywny fenotyp SCA siedem, który różni się znacząco od nietransgenicznych braci z miotu. Co istotne, ten wzrost wyniku fenotypowego w czasie jest zgodny z progresywnym charakterem ludzkiej choroby.
Właśnie zaprezentowaliśmy, jak wykorzystać złożony system oceny fenotypu do ewaluacji ciężkości i progresji choroby w modelach mysich ataksji móżdżkowej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że otyłość jest czynnikiem zakłócającym we wszystkich czterech opisanych testach. Wyniki poszczególnych testów można analizować osobno, aby najpierw ustalić ich optymalną kombinację w złożonym systemie oceny fenotypu, najlepiej dopasowaną do stosowanego modelu mysiego.
To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół ilościowej oceny nasilenia choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej. Ocena obejmuje testy przykurczu kończyn tylnych, sprawności na krawędzi, chodu oraz kifozy, co pozwala na skuteczne odróżnienie osobników chorych od zdrowych oraz monitorowanie progresji choroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Ocena behawioralna
- Mysie modele chorób
Wstęp
- Ataksja móżdżkowa charakteryzuje się zaburzeniami koordynacji i równowagi.
- Modele mysie są powszechnie wykorzystywane do badania chorób neurodegeneracyjnych.
- Systemy oceny fenotypu pomagają w ewaluacji stopnia zaawansowania choroby.
- Wiele testów pozwala na kompleksową ocenę funkcji motorycznych.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego systemu punktacji do oceny ciężkości choroby.
- Monitorowanie progresji objawów w modelach mysich.
- Różnicowanie osobników dotkniętych chorobą od osobników zdrowych.
Zastosowane metody
- Złożony system oceny fenotypowej ze skalą od 0 do 3 dla każdego testu.
- Cztery testy: test krawędzi (ledge test), zaciskanie tylnych kończyn, ocena chodu oraz pomiar kifozy.
- Każdy test przyczynia się do wyniku łącznego w zakresie od 0 do 12.
- Bezpośredni pomiar koordynacji i funkcji mięśniowej za pomocą tych testów.
Główne wyniki
- Test krawędzi skutecznie mierzy koordynację.
- Przykurcz kończyn tylnych wskazuje na progresję choroby.
- Analiza chodu odzwierciedla koordynację i funkcję mięśni.
- Kifozę obserwuje się w modelach degeneracji układu ruchowego.
Wnioski
- Protokół zapewnia czuły pomiar nasilenia choroby.
- Umożliwia on śledzenie postępu choroby w czasie.
- Ten system punktacji może zwiększyć zrozumienie ataksji móżdżkowej w badaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół zapewnia ilościowe i powtarzalne ramy oceny fenotypów neurodegeneracyjnych w modelach przedklinicznych, wspierając walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w badaniach nad ataksją móżdżkową. Umożliwiając rozróżnienie między osobnikami dotkniętymi schorzeniem a osobnikami zdrowymi oraz śledzenie progresji czasowej, zwiększa on wiarygodność predykcyjną w wczesnych etapach procesów odkrywania leków. Zastosowanie podejścia opartego na ocenie kompozytowej zwiększa moc statystyczną i ciągłość translacyjną w procesach selekcji portfolio oraz identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościową ocenę fenotypu motorycznego.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie obiektywnej, zaślepionej oceny stopnia nasilenia choroby.
- Wartość naukowa: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez korelację wyników złożonych z interwencjami genetycznymi lub farmakologicznymi.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych wyników (skala 0-12) do przesiewania związków w modelach ataksji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testu poprzez badanie w trzech powtórzeniach i ślepą ocenę dla każdego parametru.
- Wartość naukowa: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez odróżnienie ratowania fenotypowego od zmienności bazowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodny z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie fenotypów postępującej ataksji móżdżkowej.
- Wartość operacyjna: Wspiera dostosowanie biomarkerów translacyjnych poprzez podłużne śledzenie zmian w złożonym wskaźniku punktowym.
- Wartość naukowa: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez ilościowe określenie nasilenia fenotypu i tempa progresji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, aby wspierać testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego przed etapami identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację fenotypów koordynacji, chwytania, chodu oraz krzywizny kręgosłupa.
- Przesiewanie: Zapewnia ustandaryzowane wyniki gotowe do analizy z określonymi progami punktowymi w celu wykrywania efektów związków.
- Analityka: Generuje zbiorcze i indywidualne wyniki testów, umożliwiające porównanie statystyczne między grupami traktowania.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez progresywne modelowanie fenotypowe u myszy z SCA7.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę fenotypowania z możliwością ponownego wykorzystania, którą można zastosować w wielu modelach ataksji móżdżkowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez zmniejszenie niejednoznaczności fenotypowej w modelach neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki ślepej ocenie w trzech powtórzeniach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie obiektywnej stratyfikacji stopnia nasilenia zmian.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki mierzalnym wskaźnikom progresji choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuronauki behawioralnej oraz doświadczenia w pracy z myszami w celu dokładnej oceny fenotypu.
- Zależność od standaryzowanego środowiska testowego oraz spójnego przeszkolenia obserwatorów w celu zminimalizowania zmienności.
- Konieczność międzyzespołowej standaryzacji kryteriów oceny dla zapewnienia powtarzalności w wielu ośrodkach.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu wag wyniku złożonego do różnych modeli ataksji.
- Obejmuje praktyczne ograniczenie w postaci otyłości jako czynnika zakłócającego, wymagającego normalizacji fenotypowej.
