Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie rozwijających się embrionów pochodzących z miejsc oocytów (OO), które były manipulowane w hodowli. Jest to osiągane poprzez wstępne wyizolowanie miejsc oocytów od jednej samicy-donora i poddanie ich pożądanym manipulacjom w hodowli. Drugim krokiem procedury jest stymulacja dojrzewania tych cyto-komórek przy użyciu progesteronu oraz wstrzyknięcie gonadotropiny potencjalnym samicom-gospodarzom w celu stymulacji składania jaj.

Trzecim krokiem procedury jest barwienie cytów dawcy barwnikami witalnymi oraz przygotowanie samicy, która będzie pełnić rolę biorcy. Ostatnim etapem procedury jest chirurgiczne przeniesienie cytów dawcy do jamy ciała biorcy, a po kilku godzinach odzyskanie i zapłodnienie przeniesionych komórek jajowych. W rezultacie otrzymuje się prawidłowo dzielące się embriony pochodzące od eksperymentalnie manipulowanego dawcy.

Cytes można pozyskać i analizować w taki sam sposób, jak normalne embriony. Dzień dobry, nazywam się Doug Houston z University of Iowa. Jesteśmy dziś na kursie Xap w Cold Spring Harbor, aby pokazać Państwu, jak przeprowadzić procedurę transferu do gospodarza.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę w celu zbadania roli produktów genów matczynych oraz określenia ich funkcji we wczesnym rozwoju zap. Zacznijmy zatem. Przed przystąpieniem do operacji należy upewnić się, że obszar zabiegowy został zdezynfekowany, a świeże pożywki i sterylne narzędzia są przygotowane.

Chwyć igłę chirurgiczną za pomocą igłotrzymacza w pożądanej orientacji. Umieść znieczuloną samicę żaby na grzbiecie na wilgotnej chusteczce chirurgicznej. Używając małych nożyczek irydowych, wykonaj jedno centymetrowe nacięcie skóry w dolnej części brzucha, bocznie od linii środkowej.

Nie przecinaj mięśni brzucha. Użyj pęsety, aby unieść warstwę mięśniową i otaczającą ją białą powięź. Za pomocą nożyczek irydowych wykonaj jedno szybkie cięcie prostopadle w dół przez mięsień.

Przedłużyć nacięcie do jednego centymetra, odsłaniając jajnik. Za pomocą pęsety chwycić jajnik i wyciągnąć płat. Za pomocą nożyczek odciąć płat na poziomie ściany ciała.

Umieść tkankę w szalce 90 mm zawierającej pożywkę do hodowli oocytów lub OCM, a następnie niezwłocznie oceń jakość jajnika pod mikroskopem stereoskopowym. Kilka oocytów można wydzielić za pomocą pęsety. Jeśli oocyty są twarde, mają jednolity rozmiar i zabarwienie, pobierz z żaby odpowiednią ilość tkanki jajnika i umieść ją w szalce Petriego 90 mm z OCM.

Zamknij nacięcie. Wprowadź igłę kilka milimetrów bocznie od nacięcia, upewniając się, że przechodzi ona zarówno przez mięsień, jak i powięź. Użyj pęsety do manipulowania igłą, uważając, aby nie wyciągnąć końcówki nici całkowicie.

Zamknąć ranę, stosując szwy pojedyncze przerywane oraz chirurgiczne węzły kwadratowe. Technika ta została szczegółowo opisana w towarzyszącym tekście. Powtórzyć szycie w obrębie warstwy skóry.

Opłucz samicę wodą dejonizowaną i umieść ją w wiadrze regeneracyjnym wypełnionym chłodną wodą. Bezpośrednio po zakończeniu operacji użyj nożyczek, aby podzielić jajnik. Rozetnij poszczególne płaty, rozpłaszcz je i potnij na kawałki o wymiarach dwóch centymetrów kwadratowych.

Opłukać w czystym medium i użyć pęsety. Przenieść od pięciu do sześciu fragmentów do nowej szalki 90 mm z OCM w celu wyizolowania pojedynczych cytów. Rozpocząć od przeniesienia jednego z fragmentów do małej szalki z medium i umieścić pod mikroskopem sekcyjnym.

Za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej ręcznie wyizoluj od 3 do 500 oocytów. Chwyć warstwę tkanki łącznej otaczającą w pełni rozwinięty oocyt w stadium szóstym w pobliżu zapasu drugą pęsetą. Chwyć jajnik sąsiadujący z oocytem pierwszą pęsetą.

Lekko pociągnij w poprzek oocyta, aby przerwać warstwę pęcherzykową. Ostrożnie oddziel oocyt od tkanki. Odfolikularne oocyty nie posiadają widocznych naczyń krwionośnych i są bardziej wiotkie niż oocyty z nienaruszoną warstwą pęcherzykową.

Używając pipety z ogniowo wypalonym końcem zatkanej watą, przenieś grupy od 100 do 150 oocytów do 60 milimetrowych naczyń hodowlanych zawierających osiem mililitrów OCM. Przechowuj oocyty w naczyniach w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Oocyty można teraz mikroiniekować zgodnie z potrzebami oligosuklenotydami antysensownymi lub mRNA, stosując dowolny protokół, a następnie hodować w OCM w inkubatorze w temperaturze 18 stopni Celsjusza.

Oocyty do transferu należy wykorzystać w ciągu 96 godzin od izolacji, w wieczór poprzedzający wykonanie transferu. Niezbędne oocyty należy inkubować z progesteronem w celu ich dojrzewania, dodając 16 µL 1 mM progesteronu do medium zawierającego komórki, aby uzyskać stężenie końcowe 2 µM. Inkubować przez 10 do 12 godzin w temperaturze 18 °C tego samego wieczoru, a następnie wstrzyknąć trzem do pięciu samicom 1000 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej na jedną żabę, aby indukować składanie jaj.

W dniu transferu, rano, pozostaw samice w temperaturze pokojowej lub 18°C na noc. Sprawdź pod stereomikroskopem, czy hodowane oocyty uległy dojrzewaniu. Dodaj barwniki witalne i wiruj z prędkością powyżej 10 000 ×g przez pięć minut.

Aby zmniejszyć tło spowodowane zanieczyszczeniami, do każdej grupy doświadczalnej oocytów należy dodać 80 µl odpowiedniego barwnika witalnego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut na kołysarce. Przenieść zabarwione komórki jajowe do 90 mm szalki ze świeżym o cm i krótko zamieszać w celu ich wypłukania.

Przygotuj pipetę do przenoszenia cytów. Użyj rysika diamentowego, aby naciąć pipetę około dwóch centymetrów poniżej części zwężonej, a następnie przełam ją gładko. W ten sposób powstanie pipeta o średnicy otworu 1,5 mm, wystarczająco dużej, aby pomieścić oocyt.

Szlifuj końcówkę, aż krawędzie będą gładkie, uważając, aby nie zamknąć otworu. Transplantacja oocytów. Zabieg chirurgiczny należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe.

Wykonaj nacięcie, tak jak wcześniej, u znieczulonej samicy znoszącej jaja dobrej jakości. Nacięcie to powinno mieć minimalną długość, niezbędną do zmieszczenia otworu transferowego. Odpipetuj mniej niż jeden centymetr.

Zawirować naczynie z oocytami eksperymentalnymi, aby zebrać je w centrum naczynia. Za pomocą przygotowanej pipety pasterskiej odessać jak największą ich liczbę. Pozostawić oocyty, aby osiadły na końcu pipety, w celu zminimalizowania ilości cieczy przenoszonej do żaby.

Za pomocą pęsety chwyć i unieś jeden płat mięśnia i powięzi. Wprowadź końcówkę pipety do nacięcia i powoli pozwól oocytom spłynąć do jamy ciała. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie oocyty zostaną przeniesione.

Nie zwalniaj warstwy mięśniowej, aby zapobiec wypadnięciu oocytów przez nacięcie. Za pomocą pęsety chwyć obie strony nacięcia i zbliż je do siebie, pozwalając komórkom osiąść w jamie ciała. Rozpocznij szycie warstwy mięśniowej i powięzi w sposób opisany wcześniej, dbając o zachowanie napięcia w górę aż do zawiązania pierwszego węzła.

Zszyj skórę. Przepłucz żabę wodą dejonizowaną i pozwól jej dojść do siebie, tak jak wcześniej. Żaba powinna normalnie rozpocząć składanie jaj od dwóch do trzech godzin po operacji.

Odzyskiwać jaja poprzez standardowe wyciskanie co pół godziny do naczynia z zebranymi jajami, aż samica przestanie składać jaja. Dodać cztery mililitry zawiesiny świeżo pobranego nasienia w podłożu 1X MMR i inkubować w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Obficie zalać i wypłukać jaja w temperaturze pokojowej.

Punkt pierwszy: XMMR inkubowano w temperaturze pokojowej, aby umożliwić aktywację i rozszczepienie. W dowolnym momencie można zastosować cysteinę w celu usunięcia otoczek galaretowatych. Przeniesione embriony można następnie posegregować do oddzielnych naczyń w zależności od koloru i hodować jak zwykłe embriony.

Zazwyczaj ponad dwie trzecie przeniesionych jaj aktywuje się w ciągu kilku minut od zapłodnienia, wykazując silny skurcz korowy w obrębie bieguna zwierzęcego. W większości eksperymentów ponad połowa przeniesionych jaj przechodzi prawidłowy pierwszy podział. Czasami podział ten może być opóźniony o około 20 minut w stosunku do jaj gospodarza w naszych doświadczeniach.

Od 30 do 60% przeniesionych embrionów normalnie przechodzi do stadium gastruli i przeżyje etap neurulacji. Przeniesione embriony zachowają kolor barwnika witalnego przez wiele dni rozwoju. Embriony pochodzące z nieiniekcyjnych oocytów kontrolnych będą wyglądać normalnie, zgodnie z oczekiwaniami.

Z kolei zarodki pochodzące z oocytów wstrzykniętych beta-kateniną i oligosami antysensownymi będą miały wygląd scentralizowany. Przedstawiliśmy właśnie sposób uzyskiwania zarodków z oocytów manipulowanych w hodowli.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby rozpocząć od zdrowych, w pełni rozwiniętych oocytów dawcy oraz wykorzystać samice biorców z jajeczkami wysokiej jakości. Ponadto sukces tej metody wykazuje tendencję do korelacji z szybkością izolacji oocytów i przeprowadzania zabiegów chirurgicznych. W związku z tym osiągnięcie spójnych wyników może wymagać pewnej wprawy.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.