Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis
23 maja 2010
Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metod obrazowania na żywo oraz prostych metod ilościowych służących do analizy morfologii embrionalnych komórek nabłonkowych. Zostaje to zrealizowane poprzez przygotowanie wszystkich niezbędnych narzędzi i aparatury. Drugim krokiem procedury jest wycięcie eksplantów X z embrionów żaby i umieszczenie ich w komorach do długoterminowej hodowli.
Trzecim krokiem procedury jest gromadzenie obrazów komórek nabłonkowych w wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Ostatnim krokiem procedury jest ilościowe określenie szczegółów morfologicznych komórek nabłonkowych przy użyciu programu Image J. W rezultacie można uzyskać obrazy przedstawiające śledzone obszary komórek oraz intensywność błon dzięki konfokalnej mikroskopii wysokiej rozdzielczości. Cześć, jestem Sagar Joshi z Laboratorium Davidsona w Departamencie Bioinżynierii na Uniwersytecie Pittsburgha.
Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania żywych komórek oraz analizy ilościowej embrionalnych komórek nabłonkowych Xenos lavia. Procedurę tę wykorzystujemy do badania zmian w cytoszkielecie komórkowym w czasie rzeczywistym. Zapraszamy do oglądania.
Aby przygotować komory do hodowli kapturem zwierzęcych, należy użyć smaru silikonowego do uszczelnienia wykonanej na zamówienie komory akrylowej lub małej nylonowej podkładki do dużego szkiełka podstawowego o wymiarach 45 by 50 mm. Do komory należy dodać 1 mL 1%BSA w jednej trzeciej XMBS. Małe fragmenty szkiełek nakrywkowych należy pokryć tym samym roztworem i inkubować przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
Aby zmniejszyć adhezję eksplantu X do szkła, należy wypłukać i napełnić komorę medium DFA. Przed przeniesieniem eksplantów, fragmenty szkiełka nakrywkowego należy wypłukać w ten sam sposób. Następnie zanurzyć je w naczyniu z embrionami w kulturze DFA, które zostały mikroiniekcyjne na etapie od jednej do czterech komórek pożądanym MR NA do pożądanego etapu w jednej trzeciej XMBS. Należy użyć pipety transferowej ze skośnym otworem, aby przenieść embriony do naczynia z DFA pod stereo-mikroskopem dissectingowym.
Za pomocą pęsety przygotuj embriony do wycięcia zwierzęcej części czapki (CapEx). Użyj pętli z włosa, aby ustabilizować embrion w jednej pozycji. Użyj noża z włosa, aby wykonać niewielkie nacięcie w biegunie zwierzęcym.
Wykonuj powtarzalne, płynne cięcia typu „flick”, aby poszerzyć nacięcie i usunąć ektodermę czepka. W ten sam sposób wycinaj od trzech do czterech eksplantów. Następnie za pomocą pipety transferowej przenieś je do przygotowanej komory hodowlanej.
Używając pętli z włosa, umieść każdy X explan w taki sposób, aby nabłonek był skierowany w stronę dna komory. Używając pęsety, przytrzymaj fragment szkiełka nakrywkowego za jego środek.
Zanurz końce w smarze silikonowym. Umieść jeden fragment nad każdym X explan. Delikatnie przymocuj każdy fragment za pomocą niewielkich kropel smaru silikonowego.
Należy uważać, aby nie zmiażdżyć całkowicie X explan nadmierną siłą. Wypełnić komorę DFA i pokryć górne krawędzie komory smarem silikonowym. Następnie zamknąć górę szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 40 milimetrów.
Dostosuj poziom DFA w komorze, aby zredukować pęcherzyki powietrza, a następnie użyj chusteczki do odsączenia nadmiaru cieczy. Rośliny X mogą być teraz hodowane długoterminowo w zamkniętej komorze przez jeden dzień w temperaturze pokojowej; przesuń obiektyw 20x mikroskopu konfokalnego na miejsce. Umieść komorę zawierającą preparat X na stoliku mikroskopu i połóż na komorze niewielkie ciężarki stabilizujące, aby utrzymać ją w pozycji w świetle pola jasnego.
Wyreguluj ostrość i wykorzystaj pozycjonowanie w osi Z, aby zwizualizować końce apikalne komórek powierzchniowych. Przełącz na tryb fluorescencji i użyj obiektywu o większym powiększeniu. Aby zebrać pojedyncze obrazy lub filmy time-lapse nabłonka rozpostartego, dostrój parametry akwizycji, aby uzyskać możliwie najlepszy obraz.
W celu uzyskania wskazówek dotyczących strojenia i obrazowania należy zapoznać się z pisemną częścią niniejszego protokołu. Należy utrzymywać moc lasera na możliwie najniższym poziomie. Należy zarejestrować obrazy lub filmy time-lapse nabłonka x explan.
W celu uzyskania sugestii dotyczących gromadzenia danych należy odnieść się do pisemnej części protokołu. Pliki obrazów konfokalnych mogą być analizowane pod kątem danych na różne sposoby. Poniżej przedstawiono dwa przykłady analizy plików danych przy użyciu oprogramowania analizującego Image J z wtyczką bio formats.
Aby zmierzyć powierzchnię komórki nabłonkowej, rozwiń menu analyze i kliknij set measurements. Wybierz narzędzie selection tool z paska narzędzi i obrysuj komórkę; w menu analyze wybierz tools, a następnie ROI manager. Aby otworzyć menedżera obszarów zainteresowania, naciśnij control t.
Aby dodać obrysy do menedżera ROI, zaznacz i dodaj z obrazu taką liczbę obrysów, jaka jest potrzebna. Następnie kliknij „save”, aby zapisać zestaw ROI w menedżerze ROI. Kliknij „measure”.
Okno wyników wyświetli teraz zmierzone obszary każdego ROI. Aby zmierzyć intensywność błony komórkowej, należy wybrać narzędzie linii prostej z paska narzędzi ImageJ. Należy narysować linię prostopadłą do błony.
Naciśnij CTRL T, tak jak w poprzednim przykładzie. Aby dodać zaznaczenie do menedżera ROI, rozwiń menu Analyze i kliknij Plot Profile, aby wygenerować wykres względnych intensywności wzdłuż linii. Aby zapisać wykres jako obraz, kliknij Save w nowym oknie wykresu, które się pojawi.
Rozwiń menu listy do pliku, a następnie zapisz jako. Właśnie pokazaliśmy, jak obrazować na żywo i kwantyfikować embrionalne komórki nabłonkowe z wyciętym eksplantem CapEx zwierzęcia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dodaniu antybiotyku i antybiotyku do DFA. Aby zapobiec wzrostowi bakterii i grzybów, należy zachować szczególną ostrożność podczas dociskania eksplantów pod szkiełkami nakrywkowymi, ponieważ zbyt silny nacisk może zmiażdżyć eksplant.
Ważne jest również pamiętanie o zastosowaniu optymalnych ustawień mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać dane obrazowe o najwyższej jakości. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł prezentuje techniki obrazowania na żywo służące do badania morfologii zarodkowych komórek nabłonkowych u Xenopus. Przedstawiono w nim metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Nabłonki embrionalne Xenopus służą jako model do badania zachowań komórkowych.
- Obrazowanie żywych komórek uzupełnia tradycyjną histologię.
- Zrozumienie morfogenezy nabłonka jest kluczowe dla badań nad rozwojem.
- Mikroskopia konfokalna umożliwia wizualizację dynamiki komórkowej w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Przedstawienie technik obrazowania na żywo dla komórek nabłonkowych.
- Ilościowa ocena szczegółów morfologicznych komórek nabłonkowych.
- Przedstawienie protokołu izolacji i hodowli tkanek żaby.
Zastosowane metody
- Przygotowanie narzędzi i aparatury do obrazowania.
- Wycinanie tkanek z embrionów żaby do hodowli.
- Pozyskiwanie obrazów wysokiej rozdzielczości komórek nabłonkowych.
- Kwantyfikacja morfologii komórek przy użyciu oprogramowania Image J.
Główne wyniki
- Uzyskano obrazy żywych komórek nabłonkowe o wysokiej rozdzielczości.
- Analiza ilościowa pozwoliła wyznaczyć śledzone obszary komórek oraz intensywność sygnału z błon.
- Obrazowanie na żywo dostarczyło informacji na temat zachowania komórek podczas morfogenezy.
- Metody zostały zwalidowane pod kątem długoterminowej hodowli tkanek żaby.
Wnioski
- Konfokalna mikroskopia żywych komórek jest skuteczną metodą badania komórek nabłonkowych.
- Opisane metody można zastosować w różnorodnych badaniach z zakresu biologii rozwoju.
- Wyniki pogłębiają zrozumienie morfogenezy nabłonka.
Najczęściej zadawane pytania
Przemysłowe zastosowanie i znaczenie
Obrazowanie żywych komórek oraz analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonka u Xenopus laevis stanowią dynamiczną platformę do badania procesów morfogenetycznych istotnych dla wczesnego etapu odkryć i walidacji celów terapeutycznych. Konfokalna mikroskopia o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar morfologii komórkowej i lokalizacji białek w czasie rzeczywistym, co zwiększa wiarygodność prognostyczną modeli biologii rozwoju. Niniejszy schemat postępowania zwiększa wartość translacyjną systemów nabłonkowych w zakresie ograniczania ryzyka mechanistycznego i selekcji projektów w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację zmian cytoszkieletu i dynamiki kształtu komórek w czasie rzeczywistym.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów molekularnych biorących udział w morfogenezie nabłonkowej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie zmian powierzchni komórek i intensywności błony.
- Zapewnia platformę do weryfikacji hipotez dotyczących szlaków rozwojowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy żywych komórek do dalszych procesów ilościowego obrazowania.
- Standaryzuje pomiar parametrów morfologicznych przy użyciu powtarzalnej analizy w programie Image J.
- Umożliwia wysokoprzepustowy screening związków wpływających na zachowanie komórek nabłonkowych.
- Zapewnia skalowalność testu i możliwość ponownego wykorzystania platformy w badaniach porównawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu choroby dzięki rejestrowaniu dynamicznych procesów nabłonkowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną za pomocą wyników ilościowych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, dostarczając predykcyjnych odczytów komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Wspiera identyfikację biomarkerów poprzez obrazowanie na żywo lokalizacji białek.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkryć, od wczesnego testowania hipotez po walidację modeli przedklinicznych, wykorzystując obrazowanie żywych komórek do generowania wiarygodnych danych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez analizę morfologiczną w czasie rzeczywistym.
- Przesiewy: Zapewniają powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Pozwala na precyzyjne pomiary powierzchni komórek i intensywności błony do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączą etap odkryć z badaniami przedklinicznymi poprzez wspieranie modelowania układów istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania platformy obrazowania i analizy w różnorodnych badaniach nad nabłonkiem.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w biologii nabłonka.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności w procesach obrazowania żywych komórek.
- Wartość strategiczna: Uzasadnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów na etapie odkryć.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej i ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury obrazującej oraz oprogramowania analitycznego (np. Image J).
- Konieczna jest standaryzacja protokołów obrazowania i pomiarów pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych systemów modelowych lub typów tkanek.
- Zależne od optymalnych warunków hodowli oraz starannego obchodzenia się z próbkami w celu zapewnienia jakości danych.
