Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach Zebrafish.
24 czerwca 2010
Opisujemy opracowanie systemu do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów zebrafish w płytkach wielodołkowych. System ten wykazuje możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego Fibroblast Growth Factor i dostarcza technologii do tworzenia wysokoprzepustowych skriningów chemicznych na zebrafish.
W niniejszym filmie przeprowadzono obrazowy wysokoprzepustowy screening (HCS), aby ocenić modulację szlaku kinazy MAPK czynnika wzrostu fibroblastów za pomocą małych cząsteczek. W zarodkach danio pręgowanego skrzyżowano transgeniczne samce i samice typu dzikiego w klatce hodowlanej. Zapłodnione jaja opadają na dno, gdzie są zbierane i przenoszone do szalki Petriego. Zarodki inkubowano przez noc, a następnie umieszczono w poszczególnych studzienkach okrągłodنnej płytki 96-dołkowej.
Mała cząsteczka BCI jest dodawana w celu hiperaktywacji sygnalizacji FGF, a płytka jest inkubowana przez sześć godzin. Obrazy z każdej studni są rejestrowane za pomocą konfokalnego czytnika płytek i analizowane przy użyciu autorskiego algorytmu, który raportuje intensywność fluorescencji w konkretnych strukturach embrionalnych. Cześć, jestem Hiba Kado z laboratorium dr. Michaela Changa z Katedry Mikrobiologii i Genetyki Molekularnej na Uniwersytecie w Pittsburghu.
Witam, nazywam się Andrea Spock z Instytutu Odkrywania Leków na Uniwersytecie w Pittsburghu. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę rozmnażania, selekcji i rozmieszczania embrionów danio pręgowanego w celu przeprowadzenia obróbki chemicznej. W płytce 96-dołkowej wykorzystamy embriony transgeniczne raportujące aktywność czynników wzrostu fibroblastów, które zostaną poddane działaniu cząsteczki hiperaktywującej tę ścieżkę.
Przedstawimy sposób wykorzystania metodologii wysokoprzepustowego przesiewania obrazowego (high content screening) do automatycznej akwizycji, analizy i kwantyfikacji aktywności czynnika wzrostu fibroblastów w embrionach transgenicznych danio pręgowanego. Procedura ta zaprezentuje technologię platformową pozwalającą na wykorzystanie transgenicznych rybek danio oraz wysokoprzepustowych przesiewów chemicznych. Przejdźmy zatem do realizacji.
Na dwa dni przed rozpoczęciem zabiegu należy wytypować homozygotyczne samce transgeniczne danio pręgowanego i umieścić je w oddzielnych zbiornikach do tarła. W zbiornikach należy zainstalować przegrody, a następnie do każdego z nich dodać samicę typu dzikiego i pozostawić ryby w klatkach do tarła na noc w temperaturze 28°C. Następnego ranka należy usunąć przegrodę. Po godzinie ryby należy przenieść do nowego zbiornika, a embriony przelać przez plastikowe sito.
Przenieść zarodki do szalek 100 mm z roztworem E3 i inkubować w temperaturze 28 °C przez sześć do ośmiu godzin. Po inkubacji zbadać zarodki pod mikroskopem stereoskopowym. Zarodki odpowiednie do eksperymentów będą znajdować się w fazie gastrulacji.
W tym momencie należy usunąć wszystkie niezapłodnione embriony, które pozostaną w stadium jednej komórki. Należy również usunąć embriony nieżywe, które wydają się nieprzezroczyste lub zdeformowane. Następnie należy dodać świeży roztwór E three i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C.
Następnego dnia umieść embriony pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, aby wyselekcjonować embriony transgeniczne o podobnym stadium rozwoju i jednorodnej ekspresji GFP. Embriony w 24 HPF wykazują widoczną granicę między mózgiem przednim a tylnym z intensywną ekspresją GFP oraz dobrze wykształcone oczy z GFP-dodatnimi siatkówkami grzbietowymi. Embriony te są aktywne i będą poruszać się oraz wirować w swoich chorionach podczas przenoszenia plastikową pipetą Pasteura.
Przenieś zarodki w 24 HPF pojedynczo do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej. Za pomocą mikropipety usuń nadmiar roztworu E three z dołków. Następnie, używając pipety wielokanałowej, dodaj 200 µl roztworu E three do każdego dołka.
Następnie do wszystkich dołków w kolumnach 1 i 12 należy dodać 2 µL DMSO. Następnie dodaje się 2 µL BCL przygotowanego w DMSO w następujący sposób: 1 µM do kolumn 2 i 7, 5 µM do kolumn 3 i 8, 10 µM do kolumn 4 i 9 oraz 20 µM do pozostałych.
Stężenie mikromolarne do kolumn pięciu i 10. I na koniec 25 micromolar do kolumny szóstej i 11. Teraz przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować przez sześć godzin w temperaturze 28 °C.
Dodaj 10 µL trica do każdej studni, aby znieczulić zarodki 30 HPF. Następnie wprowadź płytkę do systemu Molecular Devices ImageXpress Ultra z uruchomionym oprogramowaniem MetaXpress. Wybierz konfigurację z obiektywem 4x i maksymalną średnicą otworu przesłony (pinhole).
Skonfiguruj automatyczne ogniskowanie lasera tak, aby wykrywało dno płytki i stosowało wcześniej określone optymalne przesunięcie Z. Aby wykryć obszary zainteresowania, ustaw obszar skanowania jako pojedynczy obszar o wymiarach 2000 na 2000 pikseli bez binningu. Wybierz odpowiedni typ płytki oraz laser argonowy o długości fali 488 nanometrów przy długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i emisji 525 nanometrów.
Następnie należy wybrać dołek zawierający embrion traktowany nośnikiem i kliknąć przycisk find sample. Instrument przeprowadzi skanowanie autofokus i zarejestruje pojedynczy obraz w celu potwierdzenia prawidłowego obrazowania. Należy losowo wybrać dołek z traktowaniem nośnikiem i zarejestrować obraz.
Jeśli obraz jest ostry i wykazuje ekspresję GFP w głowie, należy umieścić kursor nad najjaśniejszymi obszarami i zweryfikować, czy intensywność fluorescencji mieści się w zakresie 16-bitowej kamery, tj. poniżej 65 000 jednostek.
Powtórz te kroki z innym kontrolnym nośnikiem oraz kilkoma studzienkami traktowanymi związkiem. W razie potrzeby dostosuj moc lasera i wzmocnienie w taki sposób, aby najjaśniejsze obszary na obrazach kontroli pozytywnej nie uległy nasyceniu. Następnie w oknie akwizycji i kontroli płytek wybierz opcję acquire plate, aby rozpocząć skanowanie płytki.
Urządzenie automatycznie pozyska jeden obraz z każdej dołka dla całej mikropłytki i zarchiwizuje je w bazie danych serwera SQL. Po zakończeniu skanowania prześlij obrazy do D definition's. Developer, otwierając program developer z włączoną opcją slinger.
Utwórz nowy obszar roboczy. Następnie z menu pliku wybierz opcję spersonalizowanego importu. Następnie przejdź do folderu zawierającego obrazy i otwórz plik próbny.
Wybierz filtr importu, który rozpoznaje format obrazu i strukturę plików generowanych przez platformę Molecular Devices Image Express Ultra. Aby przystąpić do przetwarzania obrazów, otwórz obraz kontrolny i załaduj odpowiednią technologię sieci poznawczych (cognition network technology), algorytm CNT lub zestaw reguł. Zastosowany tutaj niestandardowy algorytm został opracowany w celu automatycznej identyfikacji zarodka, żółtka i głowy oraz ilościowego określenia jasności i powierzchni struktur głowy wykazujących ekspresję GFP; wykonaj zestaw reguł do etapu detekcji głowy i żółtka.
Aby zapewnić prawidłowe przypisanie pęcherzyka żółtkowego i głowy, zmodyfikuj zestaw reguł w celu dostosowania progu detekcji żółtka, jeśli jest ono zbyt duże lub zbyt małe. Następnie wykonaj zestaw reguł do etapu detekcji jasnych struktur głowy. Aby zapewnić prawidłowe przypisanie obszarów wykazujących ekspresję GFP w głowie, zmodyfikuj zestaw reguł, dostosowując próg detekcji struktur głowy jako wielokrotność intensywności tła, aż detekcja jasnych struktur głowy będzie zgodna z obserwacją wizualną.
Następnie należy ręcznie zastosować cały zestaw reguł na kilku losowo wybranych obrazach pochodzących z embrionów traktowanych nośnikiem oraz obrazach kontroli pozytywnej z embrionów traktowanych PCI. Aby uruchomić algorytm dla wszystkich obrazów z płytek, należy wybrać płytki do analizy i wybrać Analyze, a następnie przejść do zoptymalizowanego zestawu reguł i przeprowadzić analizę wszystkich studzienek.
Dzięki zintegrowanemu harmonogramowi zadań, puste dołki lub niejednoznaczne obrazy zostaną automatycznie wykluczone z analizy podczas skanowania. Wyświetlana jest stale aktualizowana mapa zachowania próbek. Zarówno dane, jak i obrazy są dostępne podczas uruchomienia w celu wizualnej inspekcji.
Dane liczbowe oraz przetworzone obrazy są zapisywane automatycznie. Po przeanalizowaniu wszystkich obrazów dane można wyeksportować do zewnętrznego oprogramowania, takiego jak Excel, GraphPad lub Prism. Na tej rycinie przedstawiono zarchiwizowane obrazy skanów z próbki kontrolnej oraz próbki traktowanej BCI, z przeprowadzoną analizą CNT oraz bez niej.
Zastosowaną zieloną białko fluorescencyjne lub GFP wykryto w oku, w granicy przedniego i tylnego mózgowia oraz w zwojach trójdzielnych embrionów transgenicznych. Należy zauważyć, że zarówno intensywność GFP, jak i domeny ekspresji uległy rozszerzeniu. W przedstawionych tutaj embrionach traktowanych BCI widoczny jest efekt zależny od dawki BCI na ekspresję genu reporterowego GFP w embrionach transgenicznych.
Stężenie wymagane do wywołania połowy maksymalnej odpowiedzi, czyli EC 50, wynosiło około 12 µM. Przedstawiliśmy właśnie sposób hodowli, zbierania i rozmieszczania transgenicznych embrionów danio pręgowanego w płytkach 96-dołkowych. Dodaliśmy rosnące stężenia PCI we własnym aktywatorze ścieżki sygnałowej.
Pokazaliśmy również, jak zautomatyzować obrazowanie embrionów transgenicznych, a następnie przeanalizowaliśmy obrazy za pomocą specjalnie zaprojektowanego algorytmu opartego na technologii sieci kognitywnych. Dzięki temu podejściu mogliśmy w sposób ilościowy i stopniowalny zmierzyć efekty działania małocząsteczkowego aktywatora sygnalizacji czynnika wzrostu fibroblastów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby starannie dobrać embriony, aby zminimalizować zmienność między badanymi okazami.
To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia system do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych zarodków danio pręgowanego w płytkach wielodołkowych. Wykazano w nim możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki BCI na ekspresję genu reporterowego czynnika wzrostu fibroblastów (Fibroblast Growth Factor), co usprawnia wysokoprzepustowe przesiewy chemiczne z wykorzystaniem danio pręgowanego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Przesiew wysokoprzepustowy
Wprowadzenie
- Danio pręgowany jest powszechnie wykorzystywany jako organizm modelowy w biologii rozwoju.
- Transgeniczne rybki danio mogą wykazywać ekspresję białek fluorescencyjnych, co umożliwia wizualizację ekspresji genów.
- Przesiewanie wysokoprzepustowe (high-content screening) pozwala na jednoczesną analizę wielu próbek.
- Sygnalizacja czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) jest kluczowa dla wielu procesów rozwojowych.
Cel badania
- Opracowanie systemu obrazowania wysokoprzepustowego dla zarodków rybek danio.
- Ocena wpływu małych cząsteczek na sygnalizację FGF.
- Automatyzacja analizy ekspresji genów u transgenicznych rybek danio.
Zastosowane metody
- Hodowla transgenicznych danio pręgowanych i zbieranie embrionów.
- Inkubacja embrionów w płytkach wielodołkowych z różnymi stężeniami BCI.
- Zautomatyzowane obrazowanie z wykorzystaniem konfokalnego czytnika płytek.
- Analiza intensywności fluorescencji przy użyciu autorskiego algorytmu.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie i analiza zarodków danio pręgowanego w formacie wysokoprzepustowym.
- Wykazanie zależnych od dawki efektów BCI na sygnalizację FGF.
- Zautomatyzowana analiza zapewniła wiarygodną kwantyfikację ekspresji genów.
- Ustanowienie platformy do przyszłych badań przesiewowych związków chemicznych u danio pręgowanego.
Wnioski
- Opracowany system zwiększa wydajność chemicznych przesiewów z wykorzystaniem danio pręgowanego.
- Stanowi on wartościowe narzędzie do badania sygnalizacji FGF w procesach rozwojowych.
- Metodologia ta może zostać zastosowana do innych małych cząsteczek i szlaków sygnalizacyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Zautomatyzowane obrazowanie i analiza embrionów zebrafish umożliwiają skalowalną ocenę in vivo modulacji szlaków sygnalizacyjnych, co wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków. Podejście to zapewnia ilościowe odczyty zależne od dawki, które zwiększają pewność prognostyczną w zakresie wpływu związków na aktywność szlaku FGF/RAS/MAPK. Upozycjonowuje to metodę jako pomost translacyjny pomiędzy przesiewaniem fenotypowym a identyfikacją związków wiodących w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez modulowanie sygnalizacji FGF w istotnym dla danej choroby systemie kręgowców.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki zautomatyzowanej kwantyfikacji ekspresji reportera GFP w strukturach głowy zarodka.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane EC50 (około 12 micromolar dla BCI) w celu określenia relacji struktura-aktywność oraz selekcji projektów w portfolio.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych, powtarzalnych odczytów intensywności fluorescencji z formatów płytek 96-dołkowych, kompatybilnych z procesami wysokoprzepustowymi.
- Skalowalność: Umożliwia układanie embrionów transgenicznych w 24 hpf w celu podania związków i automatycznego obrazowania za pomocą konfokalnych czytników HCS.
- Użyteczność algorytmu: Specjalistyczny algorytm Cognition Network Technology wykrywa i kwantyfikuje ekspresję GFP w określonych obszarach embrionalnych, co pozwala na wiarygodną ocenę związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie embrionów danio pręgowanego w 24–48 hpf, co stanowi stadium rozwojowe z uformowanymi organami i przejrzystością tkanek, wspierając ekstrapolację z badań in vivo do badań przedklinicznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pomiar odpowiedzi specyficznych dla danej ścieżki (aktywacja FGF) w celu odróżnienia efektów celowanych od efektów pozacelowych związku.
- Zgodność z biomarkerami: Ekspresja reportera GFP służy jako biomarker translacyjny dla modulacji ścieżki FGF, wykrywalny za pomocą zautomatyzowanej analizy obrazu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez w walidacji celów terapeutycznych oraz umożliwiając skalowalny rozwój testów dla kampanii identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i zwiększenie pewności co do wybranego celu poprzez analizę zależności dawka-odpowiedź w modulacji sygnalizacji FGF.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testu dzięki zautomatyzowanemu pozyskiwaniu i analizie obrazów, co gwarantuje powtarzalność w różnych stężeniach związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (intensywność i powierzchnia GFP), co umożliwia porównanie siły i skuteczności związków.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną dzięki wykorzystaniu embrionów kręgowców o konserwatywnych szlakach sygnalizacyjnych i widocznej organogenezie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania wielu małych cząsteczek i szlaków sygnalizacyjnych przy użyciu wymiennych reporterów transgenicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki zautomatyzowanemu obrazowaniu i analizie opartej na algorytmach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie ilościowych, zależnych od dawki danych na temat aktywności szlaku.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wskaźniki EC50 i maksymalnej odpowiedzi.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w hodowli rybek danio pręgowanych, obchodzeniu się z embrionami transgenicznymi oraz w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od aparatury do konfokalnego screeningu wysokoprzepustowego (np. Molecular Devices ImageXpress Ultra) oraz oprogramowania do analizy obrazu (Definiens Developer).
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie określania stadium rozwoju embrionów, przygotowania związków oraz parametrów akwizycji obrazu.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu algorytmu do różnych reporterów transgenicznych lub struktur embrionalnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność embrionów oraz konieczność starannego doboru preparatów w celu zminimalizowania szumów, zgodnie z zapisami w protokole.
