Wielkoskalowe badania z wykorzystaniem rybek zebrafish In vivo Przesiewanie małych cząsteczek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest odkrycie małych cząsteczek, które specyficznie modulują kluczowe aspekty rozwoju i fizjologii embrionalnej. Osiąga się to poprzez umieszczenie dużej liczby zapłodnionych jaj w płytkach 96-dołkowych, które służą jako etap przesiewowy. Następnie do płytek 96-dołkowych z zarodkami dodaje się alikwoty z biblioteki małych cząsteczek.

Płytki wielodołkowe są analizowane pod kątem fenotypów wywołanych przez małe cząsteczki. Uzyskane wyniki wskazują, które małe cząsteczki specyficznie wpływają na rozwój lub fizjologię super ryb. Witam, nazywam się Charles Hong z Vanderbilt University School of Medicine.

W naszym laboratorium przeprowadzamy wysokoprzepustowe przesiewy chemiczne z wykorzystaniem embrionów danio pręgowanego. Jest to stosunkowo prosta technika, którą można szeroko adaptować w celu odkrywania nowych związków bioaktywnych. Po południu w dniu poprzedzającym przesiew chemiczny przygotuj od 10 do 20 zbiorników hodowlanych dla danio pręgowanego.

W każdym zbiorniku należy umieścić przegrodę, a następnie napełnić zbiorniki wodą z systemu akwakultury, przenosząc za pomocą siatki jeden dorosły osobnik męski oraz jedną lub dwie dorosłe samice do wewnętrznego pojemnika. W dniu przeprowadzenia doświadczenia, rano, należy odpowiednio oznakować zbiorniki hodowlane i przykryć je pokrywami. Następnie należy usunąć przegrody ze zbiorników hodowlanych, aby umożliwić danio pręgowanym rozród.

Przez następną godzinę należy pozwolić zapłodnionym ikrom przesiąknąć przez siatkę znajdującą się na dnie każdego wewnętrznego pojemnika. Po upływie jednej godziny dorosłe ryby zebry należy przenieść z powrotem do stałych zbiorników hodowlanych.

Wyjąć wewnętrzny pojemnik i zebrać jaja, przecedzając wodę z każdego zbiornika hodowlanego przez plastikowe sitko do herbaty. Odwrócić sitko nad szalką Petriego i delikatnie je wypłukać, aby przenieść jaja do szalki. Używając butelki z wodą destylowaną zawierającej pożywkę E three, należy usunąć wszystkie niezapłodnione jaja, które mają nieprzezroczysty wygląd.

Używając jednorazowej pipety plastikowej, z każdego krzyżowania powinno powstać około 200 embrionów. Następnie, za pomocą szklanej pipety Pasteura, przenieś około pięciu embrionów w medium E3 do każdej studzienki płytki 96-dołkowej. Po rozmieszczeniu embrionów na płytce 96-dołkowej.

Za pomocą pipety 12-kanałowej usuń z dołków jak najwięcej pożywki E3, uważając, aby nie uszkodzić embrionów. Następnie przy użyciu pipety 12-kanałowej nanieś 250 µL pożywki E3.

Do każdej studzienki należy jak najszybciej dodać pożywkę zawierającą 0,5 µg/mL kanamycyny, aby zapobiec wysychaniu embrionów. Płytki 96-dołkowe należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C do czasu osiągnięcia przez embriony etapu, w którym mają zostać dodane związki. W niniejszym protokole poszukujemy związków zaburzających wczesne wzorowanie embrionalne i będziemy inkubować embriony przez trzy godziny lub do momentu, gdy ponad 90% z nich osiągnie stadium 1000 komórek; biblioteki małych cząsteczek są zazwyczaj dostarczane w formie.

W 96-dołkowej płytce źródłowej, w której każdy związek jest przechowywany w DMSO jako roztwór zapasowy o stężeniu 10 millimolar, około 60 minut przed osiągnięciem przez embriony pożądanego stadium, rozmroź odpowiednią liczbę płytek 96-dołkowych zawierających alikwoty małych cząsteczek. Zanotuj numery seryjne lub inne numery identyfikacyjne płytek źródłowych, aby zminimalizować skraplanie się pary wodnej na płytkach. Umieść je w komorze osuszającej z osuszaczem.

Krótko odwirować płytki w wirówce stołowej wyposażonej w adapter do płytek wielodołkowych. Usunąć aluminiową folię zabezpieczającą z płytki źródłowej, a następnie za pomocą pipety 12-kanałowej rozcieńczyć związki w płytce źródłowej do pożądanego stężenia za pomocą DMSO. W niniejszym protokole stosujemy stężenie końcowe 0.5 millimolar i dodajemy 4.75 microliters DMSO, aby rozcieńczyć płytkę ze stężeniem zapasu 10 millimolar.

Gdy embriony w płytce 96-dołkowej osiągną pożądany etap rozwoju, należy użyć pipety 12-kanałowej do przeniesienia 2,5 µL związków z płytek źródłowych do płytek odbiorczych zawierających embriony. Płytki z embrionami i związkami należy przykryć pokrywkami, a na płytkach z embrionami zapisać numer identyfikacyjny płytek źródłowych. Płytki należy wymieszać, delikatnie nimi potrząsając, a następnie umieścić w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.

Każdą płytkę źródłową zawierającą niewykorzystane małe cząsteczki należy przykryć folią aluminiową, zakleić taśmą i umieścić w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego przechowywania. Przed przeprowadzeniem przesiewania wizualnego należy sformułować konkretne kryterium trafienia. Na przykład, w przypadku przesiewania w poszukiwaniu małocząsteczkowych inhibitorów rozwoju przedmózgowia, trafieniem może być związek powodujący utratę przedmózgowia.

Brak oczu jest łatwym wskaźnikiem wizualnym utraty przedmózgowia i nie wymaga zastosowania fluorescencji do oceny w wybranych momentach rozwoju. Wyjmij z inkubatora płytki 96-dołkowe zawierające embriony poddane działaniu związków i obejrzyj każdy dołek pod mikroskopem stereoskopowym. Podczas przesiewania w poszukiwaniu małocząsteczkowych inhibitorów rozwoju przedmózgowia, analizuj płytki po 28 godzinach w celu stwierdzenia utraty oka jako markera zahamowania rozwoju przedmózgowia. Zapisz identyfikator płytki oraz położenie dołka w każdym przypadku, gdy co najmniej trzy z pięciu embrionów wykazują określony fenotyp. Umieść płytkę 96-dołkową z powrotem w inkubatorze.

Ponownie potwierdź utratę oczu i przedmózgowia po 48 godzinach. Mimo że zarodki nie będą posiadać przedmózgowia, przeżyją one co najmniej cztery dni. Ponownie potwierdź potencjalny hit, badając wpływ związku w kilku dawkach; dla każdej dawki testowanych jest 10 zarodków w 0,5 milliliters medium E3 w formacie płytki 48-dołkowej.

Czas przygotowania związku do ponownego testowania powinien być identyczny z czasem zastosowanym podczas pierwotnego przesiewu. HIIT zostaje potwierdzony, gdy wywołany fenotyp zostanie odtworzony w sposób zależny od dawki podczas ponownego testowania związku. Na koniec należy zidentyfikować związek hi w bazie małych cząsteczek w bibliotece chemicznej.

Wykorzystując wizualny screening chemiczny oparty na danio pręgowanym, odkryliśmy małocząsteczkowy inhibitor sygnału hedgehog, bazując na jego wpływie na oś ciała. Na tym obrazie widoczne są embriony poddane działaniu inhibitora hedgehog, u których występuje wyraźne brzuszne zakrzywienie ogona. Te same embriony, badane po 24 godzinach, w 48. godzinie nadal wykazują fenotyp z brzusznie zakrzywionym ogonem.

Na obrazie przedstawiono embrion traktowany związkiem chemicznym w porównaniu z embrionem z mutacją w szlaku hedgehog. Po opanowaniu tej techniki jedna osoba może przesiewać około 400 związków tygodniowo w zaledwie kilka godzin. Technika ta utorowała również drogę biologom chemicznym do badania takich zagadnień jak rozwój komórek, szlaki sygnalizacyjne komórek oraz rozwój embrionalny.

Podczas pracy z nieopisanymi małymi cząsteczkami ważne jest przestrzeganie zasad bezpieczeństwa i stosowanie fartuchów laboratoryjnych oraz rękawiczek, ponieważ cząsteczki te mogą być potencjalnie niebezpieczne.