Test eksperymentalny przerzutowania

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie zdolności do tworzenia przerzutów przez ludzkie komórki nowotworowe poprzez wstrzyknięcia do żyły ogonowej. W myszach z niedoborem odporności przygotowywane są komórki do wstrzyknięcia. Następnie komórki są wstrzykiwane do myszy z niedoborem odporności, co po jednym lub dwóch miesiącach doprowadzi do powstania przerzutów do płuc.

Myszy są sekcjonowane, a przerzuty do płuc są kwantyfikowane i hodowane. Wyniki tego rodzaju analizy wskazują na stopień przerzutowania konkretnego typu komórek nowotworowych. Dzień dobry, nazywam się Sonali Mohanty i reprezentuję laboratorium dr LE w Katedrze Genetyki Biomedycznej na Uniwersytecie w Rochester.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeprowadzania eksperymentalnego testu przerzutowania. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania przerzutów nowotworowych. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Zacznij od komórek wyhodowanych do około 70% konfluencji; odessij pożywkę z płytki i delikatnie przemyj ją raz 1x PBS. Następnie dodaj 2 mL 0,05% trypsyny. Delikatnie potrząśnij płytką, aby ułatwić odrywanie się komórek.

Obserwuj komórki pod mikroskopem podczas ich odrywania się. Dodaj odpowiednią objętość pożywki zawierającej FBS, aby zneutralizować działanie trypsyny. Następnie przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml.

Policz komórki, używając hematocytometru. Po wyznaczeniu stężenia odwiruj zawiesinę z prędkością około 200 ×g przez trzy minuty, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ostrożnie usuń medium i resuspenderuj próbkę, dodając odpowiednią objętość zrównoważonego roztworu soli Hanksa lub HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie około 5 × 10⁶ komórek na ml.

Następnie przefiltruj zawiesinę przez sitko komórkowe Falcon o rozmiarze oczek 70 µm. Aby wyeliminować duże agregaty komórkowe, umieść końcówkę pipety bezpośrednio na filtrze umieszczonym nad probówką hodowlaną o pojemności 5 mL. Szybko wydmuchaj zawiesinę przez filtr do probówki.

Ponownie policz komórki, używając błękitu trypanowego, aby określić ich żywotność. Przed iniekcją żywotność powinna wynosić powyżej 90%. Następnie rozcieńcz zawiesinę do końcowego stężenia 2,5 × 10⁶ komórek/ml.

Przechowywać w lodzie. Delikatnie chwycić mysz z niedoborem odporności za ogon i wsunąć ją do restrainera w taki sposób, aby grzbiet przylegał do szczeliny, a ogon wystawał przez mały otwór z tyłu. Powoli przesunąć pierścień do wewnątrz wzdłuż szczeliny.

Gdy pierścień uchwyci pysk myszy, zablokuj go w tej pozycji. Mysz nie powinna móc swobodnie poruszać się, ale musi zachować normalną częstotliwość oddechów. Zlokalizuj główne żyły ogonowe.

W ogonie myszy znajdują się cztery główne naczynia krwionośne. Tętnice są rozmieszczone po stronie grzbietowej i brzusznej ogona. Żyły znajdują się po stronach bocznych.

Naciągnij co najmniej 200 µL przygotowanych komórek do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Przymocuj igłę o rozmiarze 30 G i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Końcowa objętość w strzykawce powinna wynosić 200 µL.

Przygotuj się do wstrzyknięcia w dystalny koniec ogona. Dzięki temu, jeśli pierwsza próba nie powiedzie się, do drugiej próby można będzie wykorzystać bardziej proksymalny odcinek ogona. Po przetarciu miejsca wstrzyknięcia 70% ethanol, wyprostuj ogon.

Przytrzymaj końcówkę kciukiem, a miejsce wstrzyknięcia podeprzyj palcem wskazującym. Wprowadź igłę do żyły i wstrzyknij komórki. Upewnij się, że podczas wstrzykiwania igła i strzykawka są równoległe do żyły.

W przeciwnym razie igła przebije ścianę naczynia, a komórki zostaną wstrzyknięte do sąsiednich tkanek ogona. Wyjmij igłę, jeśli procedura przebiegła pomyślnie. Krew powinna wypływać z miejsca wstrzyknięcia.

Przyciśnij czystą watkę bawełnianą, aby ułatwić oczyszczanie, i palcem przesunął w górę ogon, aby wprowadzić pozostałą próbkę do krwiobiegu. Zwolnij mysz z ograniczacza i umieść ją z powrotem w klatce. Zapisz liczbę prób wstrzyknięcia oraz liczbę wstrzykniętych komórek w dzienniku laboratoryjnym.

Oceń żywotność komórek po iniekcji. Podobnie jak poprzednio, krok ten pozwala upewnić się, że komórki pozostają żywe podczas całego procesu iniekcji. Pod koniec eksperymentu z iniekcją żywotność komórek spadnie, ale powinna pozostać powyżej 80%. Jako krok opcjonalny, odwiruj pozostałe komórki i raz wypłucz osad za pomocą PBS.

Następnie zamrozić osady w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz, takich jak western blotting. Aby potwierdzić ekspresję genów w przypadku wyciszenia (knockdown), po jednym lub dwóch miesiącach przeprowadzić sekcję myszy w celu ustalenia lokalizacji przerzutów. Rozpocząć od umieszczenia uśpionej myszy na stanowisku do sekcji.

Obficie spryskaj mysz etanolem. Rozetnij klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i serce. Następnie ostrożnie je wyciąć i umieścić w PBS.

Płuca są głównym miejscem przerzutów, ponieważ zawierają pierwsze łoże kapilarne, z którym napotykają komórki. Po ich przedostaniu się do krwiobiegu należy usunąć serce i wypłukać płuca w PBS, a następnie obejrzeć każdy płat płuc pod mikroskopem stereoskopowym. Należy policzyć liczbę wykrywalnych przerzutów po obu stronach płuc, a następnie zsumować liczbę przerzutów we wszystkich czterech płatach, aby określić całkowitą liczbę przerzutów do płuc.

Następnie, wyizoluj poszczególne przerzuty do płuc poprzez wycięcie ich nożyczkami. Przenieś każdy przerzut na sito komórkowe o oczkach 70 µm i rozdrobnij go, używając końcówki sterylnej zatyczki od igły. Przepłucz sito komórkowe kilkoma mililitrami pożywki i zbierz komórki, które przeszły przez filtr.

W naczyniu hodowlanym, w którym każde naczynie zawiera komórki z jednego przerzutu, inkubować komórki w temperaturze 37°C przez co najmniej cztery dni bez przerywania procesu. Początkowo na płytkach będą rosły zarówno komórki nowotworowe, jak i fibroblasty, lecz stopniowo fibroblasty obumrą i zostaną zastąpione przez komórki nowotworowe.

Jeśli komórki nowotworowe posiadają geny oporności na leki, należy wyselekcjonować komórki przy użyciu odpowiadających im antybiotyków. Po trzech dniach należy wypłukać krew lub pozostałości tkankowe z naczynia za pomocą PBS i dodać świeżą pożywkę. Czystość uzyskanych komórek należy ocenić poprzez immunobarwienie przeciwciałami przeciwko białkom specyficznym dla człowieka; w tym przypadku, nawet w przypadku braku selekcji lekowej, stosuje się przeciwciała anty-ludzkie. Więcej niż 99% komórek powinno być pochodzenia ludzkiego.

Nowo otrzymane komórki można ponownie wstrzyknąć myszom z niedoborem odporności, aby pod koniec tego badania przetestować ich zdolności do przerzutowania. Linia komórek nowotworowych o wysokim potencjale metastatycznym zazwyczaj daje wiele przerzutów do płuc, podczas gdy linia o niskim potencjale metastatycznym wywoła bardzo niewiele przerzutów do płuc. Przedstawione obrazy ukazują przerzuty do płuc dwa miesiące po wstrzyknięciu ludzkiej linii komórek czerniaka.

A 3 7 5 sm. Komórki uzyskane tą metodą zazwyczaj wywołują więcej przerzutów niż linia rodzicielska podczas testów. Wykorzystując ponownie ten test, zaprezentowaliśmy procedurę przeprowadzenia eksperymentalnego badania przerzutowania.

Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest dopilnowanie, aby komórki zostały wstrzyknięte do żyły ogonowej, a nie do tkanek ogona. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.