Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL
26 listopada 2010
Eksperymentalny mysi model przerzutów do płuc i immunoterapii CTL do analizy oddziaływań komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie skuteczności immunoterapii in vivo z wykorzystaniem adoptywnego transferu limfocytów T swoistych dla nowotworu. W pierwszym etapie komórki nowotworowe są przeszczepiane myszom poprzez wstrzyknięcie do bocznej żyły ogonowej w celu wywołania przerzutów do płuc. Drugim krokiem procedury jest leczenie myszy z nowotworem za pomocą swoistych dla nowotworu cytotoksycznych limfocytów T CTLs.
Ostatnim krokiem jest wykorzystanie tuszu indyjskiego w celu wizualizacji i kwantyfikacji guzków nowotworowych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące CIE różnych metod leczenia poprzez pomiar wielkości guza oraz określenie liczby guzków nowotworowych. Cześć, nazywam się Mary Zimmerman i jestem członkiem laboratorium dr. Kevina Lu w Medical College of Georgia.
Witajcie, nazywam się Shelene Hu. Jestem studentką drugiego roku i pracuję również w laboratorium dr. Lou. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak krzywe przeżywalności, jest to, że procedura ta ma charakter zarówno jakościowy, jak i ilościowy. Zastosowanie tych technik może rozciągać się na terapię nowotworów, ponieważ naśladują one adoptywną immunoterapię limfocytami T u pacjentów z chorobami nowotworowymi.
Zacznijmy zatem. Dzień przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych zasiać do kolby T75 do 1 × 10⁷ komórek CMS4 w 10 ml pożywki RPMI zawierającej 10% serum. Aby uzyskać szybko rosnące komórki nowotworowe, inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C w dniu wstrzyknięcia.
Usunąć medium i wypłukać komórki raz za pomocą PBS, następnie zebrać komórki nowotworowe, stosując 0,05% trypsyny EDTA w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Przerwać reakcję, dodając 10 ml medium RPMI zawierającego 10% serum. Przenieść komórki do probówki stożkowej.
Odwiruj komórki przy 1300 RPM w wirówce RT val legend przez trzy minuty. W temperaturze pokojowej usuń nadsącz, resuspenduj komórki w 10 mililitrach świeżego 1 XHB Ss w celu przemycia. Następnie ponownie odwiruj i resuspenduj w ten sam sposób.
Policz komórki nowotworowe za pomocą hemo.Cytometru. Rozcieńcz komórki w HBSS tak, aby resuspendować liczbę komórek wymaganą do każdego wstrzyknięcia. W całkowitej objętości 100 microliters ogrzej myszy B SEA w wieku od sześciu do ośmiu tygodni w zlewce zanurzonej w ciepłej wodzie.
Aby rozszerzyć żyłę ogonową, umieść mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej na blacie. Użyj mikrosstrzykawki, aby wstrzyknąć 100 µL komórek nowotworowych do bocznej żyły ogonowej. Stosuj technikę aseptyczną, aby uniknąć infekcji po iniekcji.
Wywieraj lekki nacisk na miejsce wstrzyknięcia, aż do ustąpienia krwawienia. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól guźowi urosnąć do pożądanego stadium. W dniu transferu pipetuj roztwór w górę i w dół, aby resuspendować przygotowane oczyszczone cytotoksyczne limfocyty T lub CTL.
Zgodnie z opisem w tekście, przenieś wszystkie komórki z jednej płytki do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml, dbając o to, aby objętość nie przekroczyła dwóch trzecich probówki. Wprowadź sterylną pipetę Pasteura do probówki stożkowatej i nanieś warstwę medium do separacji limfocytów (LSM) pod komórki, aż całkowita objętość zbliży się do 14 ml.
Należy uważać, aby nie zaburzyć warstw. Wirować z prędkością 2000 RPM przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu nie używać hamulca w celu zatrzymania rotora, a następnie przenieść CTLs do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów.
Dodać HBSS do objętości około 10 mililitrów w celu przemycia. Odwirować komórki przy 1300 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie resuspender w HBSS do wymaganej gęstości komórkowej niezbędnej do iniekcji.
Utrzymaj całkowitą objętość na wtrysk na poziomie 100 microliters. Zastosuj tę samą technikę wtryskiwania do ogona, którą zaprezentowano wcześniej w tym filmie. Aby wstrzyknąć CTL do myszy z nowotworem, umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól CTL oddziaływać z guzem.
Myszy są zazwyczaj uśmiercane w celu przeprowadzenia analizy od 14 do 21 dni po leczeniu CTL. Aby zwizualizować przerzuty do płuc, należy położyć uśmierconą mysz na plecach na styropianowej płytce. Przyprzypnij kończyny, aby zapewnić niezakłócony dostęp do tchawicy.
Spryskaj stronę brzuszna 70% etanolem, zaczynając od środka odwłoka. Za pomocą nożyczek przetnij wzdłuż linii środkowej klatkę piersiową, kierując się ku gruczołom ślinowym. Odsłoń tchawicę.
Za pomocą pęsety usuń tkanki otaczające tchawicę. Przełóż końcówkę pipety 200 µL pod tchawicę, trzymając końcówkę jedną ręką. Delikatnie unieś tchawicę do góry i odsuń ją od ciała.
Obróć platformę o 180 stopni. Używając strzykawki o pojemności 50 ml, wstrzyknij tusz indyjski do płuc poprzez tchawicę. Całkowicie wypełnij płuca tuszem, aż poczujesz silny opór.
Użyj nożyczek, aby przeciąć tchawicę. Wsuń pęsetę pod płuca i wyjmij je z organizmu myszy. Krótko opłucz płuca w zlewce z jednym litrem wody w dygestorium.
Przenieś płuca do szklanej kolby zawierającej pięć mililitrów roztworu FTI. Tkanka nowotworowa pojawi się w postaci białych guzków na czarnych płucach. Po kilku minutach można policzyć guzy, a następnie przechowywać je w roztworze FTI bezterminowo.
Płuca myszy z transfekcją raka gruczołowego piersi. Linia komórkowa 4T1 wykazuje białe punkty wskazujące na obecność guzów. Mysze z transfekcją dominującego negatywnego wariantu IRF8 K79E wykazują zwiększony potencjał przerzutowy komórek nowotworowych.
Zdjęcia te przedstawiają analizę histologiczną skuteczności immunoterapii z zastosowaniem adoptywnego transferu CTL. U myszy z nowotworami, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, sześć dni później zaobserwowano liczne guzy wskazane strzałkami. Z kolei u myszy, którym wstrzyknięto specyficzne dla nowotworu limfocyty T, w tym samym eksperymencie odnotowano redukcję guzów.
Zastosowanie tuszu indyjskiego stanowi prostszą metodę pomiaru skuteczności adoptywnego transferu limfocytów CTL. W tym przypadku białe guzki nowotworowe na płucach z przerzutami wyraźnie odróżniają je od płuc, w których adoptywny transfer CTL przebiegł pomyślnie, a liczenie guzków pozwala na stopień kwantyfikacji nieosiągalny w badaniu histologicznym. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ogrzaniu myszy, co ułatwia i zwiększa precyzję iniekcji dożylnych do ogona.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ocenić skuteczność leczenia za pomocą tej prostej procedury służącej do ilościowego określania wielkości i liczby guzów. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia model eksperymentalny do analizy interakcji między komórkami nowotworowymi a limfocytami T in vivo, ze szczególnym uwzględnieniem przerzutów do płuc oraz immunoterapii. Procedura obejmuje transplantację komórek nowotworowych do organizmów myszy oraz ich poddanie leczeniu cytotoksycznymi limfocytami T (CTLs) w celu oceny skuteczności terapii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunoterapia
- Onkologia
- Modele mysie
Wstęp
- Przerzuty nowotworowe stanowią krytyczne wyzwanie w leczeniu raka.
- Cytotoksyczne limfocyty T odgrywają kluczową rolę w zwalczaniu komórek nowotworowych.
- Zrozumienie interakcji limfocytów T z komórkami nowotworowymi może usprawnić strategie terapeutyczne.
- Modele in vivo są niezbędne do skutecznego badania tych interakcji.
Cel badania
- Ocena skuteczności immunoterapii z zastosowaniem adoptywnego transferu limfocytów T specyficznych dla guza.
- Ustanowienie modelu badania przerzutów do płuc u myszy.
- Wizualizacja i kwantyfikacja guzków nowotworowych przy użyciu tuszu chińskiego.
Zastosowane metody
- Transplantacja komórek nowotworowych poprzez wstrzykiwanie do bocznej żyły ogonowej.
- Leczenie myszy z nowotworem przy użyciu swoistych dla nowotworu limfocytów CTL.
- Wizualizacja guzków nowotworowych przy użyciu tuszu indyjskiego.
- Pomiar wielkości guza i kwantyfikacja guzków nowotworowych do analizy.
Główne wyniki
- Wyniki wskazują na skuteczność leczenia CTL w redukcji wielkości guza.
- Kwantyfikacja guzków nowotworowych dostarcza informacji na temat skuteczności leczenia.
- Model ten umożliwia szczegółową analizę interakcji między limfocytami T a komórkami nowotworowymi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia efektów immunoterapii w chorobach nowotworowych.
Wnioski
- Badanie pomyślnie ustanowiło model mysi do analizy przerzutów do płuc.
- Adaptacyjny transfer limfocytów CTL wykazuje potencjał w celowaniu w komórki nowotworowe.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu usprawnienia terapii nowotworowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model ten umożliwia przedkliniczną ocenę immunoterapii z zastosowaniem adoptywnego transferu limfocytów T poprzez ilościowe określenie stopnia przerzutów do płuc in vivo. Wspiera on walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie aktywności CTL z redukcją guzków nowotworowych. Test ten zapewnia pewność prognostyczną dla kandydatów do immunoterapii przed optymalizacją wiodących cząsteczek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza hipotezy terapeutycznej dotyczącej usuwania nowotworu przez limfocyty T w stanach przerzutowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację nowotworowo-specyficznych CTL jako czynników terapeutycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez korelację dawki CTL z supresją przerzutów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Umożliwia ilościowe określenie liczby guzków nowotworowych za pomocą barwienia tuszem indyjskim w celu uzyskania powtarzalnych pomiarów punktu końcowego.
- Skalowalność: Pozwala na modelowanie przerzutów od minimalnych do rozległych poprzez kontrolowaną inokulację komórek nowotworowych.
- Integracja procesu: Generuje standaryzowane wyniki wizualne i numeryczne do porównań międzyfunkcyjnych różnych metod immunoterapii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Naśladuje późny etap przerzutowania, koncentrując się na kolonizacji płuc, co odzwierciedla progresję przerzutów u ludzi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy przesiew immunoterapii z przedkliniczną oceną skuteczności poprzez mierzalne obciążenie nowotworowe.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Umożliwia ustalenie kryteriów go/no-go w oparciu o progi redukcji przerzutów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesów badawczych, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, zapewniając system zdolny do tworzenia przerzutów do badań przesiewowych immunoterapii.
- Biologia odkrywcza: Badanie skuteczności limfocytów T przeciwko utrwalonym przerzutom, wyjaśniające mechanizm działania in vivo.
- Przesiew: Dostarcza ilościowych danych dotyczących liczby i rozmiaru guzków w celu rankingu wiodących kandydatów do immunoterapii.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie obciążenia nowotworowego w grupach terapeutycznych przy użyciu wizualizacji z użyciem tuszu.
- Badania translacyjne: Modelowanie ludzkiej adoptywnej terapii limfocytami T poprzez ocenę migracji CTL i ich interakcji z nowotworem w płucach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do iteracyjnej oceny kandydatów do immunoterapii.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez bezpośrednie powiązanie infuzji CTL z regresją guza przerzutowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację przerzutów za pomocą metody inflacji atramentem, co poprawia powtarzalność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne odfiltrowywanie nieskutecznych immunoterapii na etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie ryzyka rozwoju projektu w oparciu o ilościowe dane dotyczące supresji przerzutów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w wstrzykiwaniu do ogonowej żyły myszy oraz w sterylnej pracy z komórkami.
- Zależne od dostępu do wirówek, komórków i tuszu indyjskiego do wizualizacji.
- Wymaga standaryzacji dawkowania komórek nowotworowych oraz oczyszczania CTL w obrębie poszczególnych badań.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy przenoszeniu metody do różnych modeli komórek nowotworowych lub odpornościowych.
- Ograniczone przez specyficzność przerzutów do płuc myszy, co może nie odzwierciedlać wszystkich miejsc przerzutowania.
