Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt
25 września 2010
Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.
Ogólnym celem tej procedury jest wstrzyknięcie do pojedynczych komórek somytów lub cewek nerwowych piskląt plazmidu kodującego zielone białko fluorescencyjne. Jest to realizowane poprzez wstępne wyciągnięcie pipet do mikroiniekcji o odpowiedniej średnicy otworu końcówki. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie zapasu plazmidu do iniekcji.
Trzecim krokiem procedury jest przygotowanie embrionów do wstrzyknięcia. Czwartym krokiem procedury jest napełnienie mikropipet plazmidowym DNA. Ostatnim krokiem procedury jest wstrzyknięcie materiału do wybranych tkanek.
Ostatecznie, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej można uzyskać wyniki wykazujące zakres pochodnych w liczbie komórek wytworzonych przez pojedynczo znakowane komórki progenitorowe w wybranych poddomenach somytów i cewy nerwowej. Cześć, jestem Rael z laboratorium profesora Heima w Departamencie Neurobiologii Medycznej na Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie. Dzisiaj przedstawimy procedurę wstrzykiwania pojedynczych komórek do somytów i cewek nerwowych kurczaka.
Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania segregacji linii komórek grzebienia neuronalnego i rurki nerwowej. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby uzyskać pojedyncze przetransfekowane komórki w embrionach kurczaka, należy rozpocząć od dociągnięcia mikropipet. Pipety dociągamy za pomocą standardowego dociągacza do pipet Naga PP 83 przy ustawieniu temperatury na 13,5.
Precyzyjne ustawienie musi zostać skalibrowane, aby uzyskać średnicę końcówki pipety od 8 do 10 mikronów. Stosujemy filament zawierający rurki z borokrzemianowego szkła o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej od 0,75 do 0,78 mm. Można również użyć dostępnych w handlu mikropipet, pozbawionych filamentu o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,75 mm.
Przygotowane pipety przechowuje się w plastikowym pojemniku w taki sposób, aby końcówki były chronione przed kontaktem z krawędzią naczynia. W celu przygotowania DNA do mikroiniekcji, interesujący nas plazmid jest transfekowany do szczepu DH5α E. coli. Następnego dnia, stosując standardowe procedury, plazmid jest oczyszczany za pomocą zestawu do Maxi prep; w przypadku iniekcji nieklonalnych stosujemy stężenie DNA wynoszące 1 µg/µL.
W przypadku eksperymentów, w których pożądane jest uzyskanie pojedynczych klonów, stężenie plazmidu będzie znacznie niższe i będzie wymagało dostosowania. Dla P-C-A-G-G-F-P-A dobrze sprawdza się stężenie od 0,05 do 0,1 microgram per microliter. Po ustaleniu optymalnego stężenia zalecamy rozcieńczenie całego zapasu oczyszczonego plazmidu do określonego stężenia, zamiast przygotowywania poszczególnych porcji.
To drugie może wprowadzić pewną zmienność w stopniu sukcesu, prawdopodobnie ze względu na różnice w czystości i innych parametrach, takich jak proporcja plazmidu superzwiniętego. Aby przygotować jaja kurzych do mikroiniekcji, jaja inkubowane w pozycji poziomej aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju przeciera się 70% ethanol i pozostawia do wyschnięcia. Następnie, za pomocą nożyczek chirurgicznych, przebija się ostry koniec jaja. Używając strzykawki o pojemności 10 mililitrów i igły o rozmiarze 19 gauge, odsysa się dwa mililitry albuminy z jaja, a następnie przed iniekcją uszczelnia otwory gorącą parafiną.
Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć okno w górnej części skorupki jaja, co zapobiegnie przedostaniu się zanieczyszczeń do otworu. Naklej kawałek taśmy na okno i wytnij w niej otwór. Aby ułatwić wizualizację zarodka, użyj kapilary wyciąganej ogniowo zamocowanej w aspiratorze, aby wstrzyknąć nietoksyczny atrament, taki jak pelican 17, pod usuniętą warstwę skóry.
Następnie uzyskaj dostęp do zarodka, przecinając i odsuwając błony szyjne i/lub łożyskowe za pomocą szpilek entomologicznych 0,14 mm zamocowanych w uchwycie do igieł, aby wprowadzić DNA do wypalanej pipety Eloqua, a następnie za pomocą kapilary dodaj niewielką ilość proszku fast green. Pobierz minimalną ilość plazmidu do kapilary o odpowiedniej średnicy za pomocą aspiratora. Następnie wprowadź ją do końca pipety przeciwległego do zaostrzonej końcówki i wprowadź DNA jak najbliżej zaostrzonego końca.
Następnie przymocuj pipetę do ręcznego wtryskiwacza ciśnieniowego zamontowanego na mikromanipulatorze. W razie potrzeby przyłóż minimalne ciśnienie, aby roztwór plazmidu dotarł do końcówki pipety. Wprowadź pipetę do cieczy jajowej, stosując niewielkie ciśnienie powietrza, aby zapobiec zapchaniu się końcówki pipety.
Po przebiciu odpowiedniego obszaru tkanki zmiana ciśnienia jest często wystarczająca, aby uwolnić plazmid z widocznym fast green. Jeśli tak się nie stanie, należy wywrzeć lekki nacisk na strzykawkę, aż do momentu wydalenia mieszaniny plazmidu z fast green. Powtórz tę procedurę wzdłuż osi zarodka; po wstrzyknięciu można dodać PBS.
Na koniec zaklej okno taśmą klejącą i umieść jaja z powrotem w inkubatorze. Unikaj wietrzenia i umieść w inkubatorze małe pojemniki z wodą, aby pomóc w utrzymaniu wilgotności i zwiększyć wydajność. Jeśli miejsce wstrzyknięcia było wystarczająco powierzchowne, aby było łatwo widoczne, np. w obrębie cewy nerwowej somity grzbietowej lub ektodermy, można zmierzyć skuteczność eksperymentu, wykonując obserwację całego preparatu przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu binokularnego.
Ten krok jest szczególnie przydatny do oceny, czy oznakowano zbyt wiele lub zbyt mało komórek. Jeśli po oględzinach planowana jest dalsza inkubacja, należy dodać do jaja roztwór antybiotyków w PBS i ponownie nakleić taśmę uszczelniającą. Ponadto stopień powodzenia iniekcji można ocenić poprzez seryjne cięcie embrionów i wykonanie immunohistochemii.
Po czterech lub więcej godzinach od wstrzyknięcia embriony są utrwalane i przygotowywane do cięcia w parafinie. Następnie preparaty zamontowane na szkiełkach są deparafinizowane i poddawane immunobarwieniu w celu wizualizacji reportera; pożądane może być zastosowanie metod amplifikacji, takich jak biotyna-streptawidyna. Na koniec seryjne przekroje są skanowane w celu wykrycia znakowanych komórek w wstrzykniętych segmentach.
Jeśli podczas pierwszych prób uzyskuje się wiele komórek zamiast pojedynczych, należy rozcieńczyć zapas plazmidu i powtórzyć proces aż do uzyskania odpowiednich wyników. Zazwyczaj wykonujemy jedną iniekcję P-C-A-G-G-F-P na jeden somit, celując w sześć do 12 segmentów w każdym embrionie. Przy takich ustawieniach wyraźny sygnał można wykryć podczas obserwacji całego preparatu (whole mount) osiem godzin po iniekcji w co najmniej jednym segmencie w jednym z 10 embrionów.
W tym przykładzie do segmentu so roztocza wstrzyknięto plazmid kodujący GFP, a pięć godzin później w widoku całego zarodka przedstawionym tutaj zaobserwowano pojedynczą fluorescencyjną komórkę. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia do centralnego segmentu so, w widoku całego zarodka dwa dni po iniekcji klonalnej zaobserwowano klon komórek fluorescencyjnych. Wykonanie przekrojów tego segmentu ujawnia obecność potomstwa klonalnego zarówno w skórze właściwej, jak i w mięśniach, co dowodzi, że pojedyncze komórki progenitorowe generują obie te pochodne.
Podobnie jak w przypadku somytów, pojedyncze neuroepithelialne komórki progenitorowe w grzbietowej części rurki nerwowej mogą zostać nakłute, co zilustrowano na tym przekroju poprzecznym, wykonanym fotograficznie pięć godzin po wstrzyknięciu. Analiza seryjnych przekrojów wykazała, że transfekcje klonalne osiągnięto przy skuteczności wynoszącej około 10%. Oznacza to, że w celu uzyskania klonalności technika ta jest z definicji wysoce nieefektywna. Z drugiej strony, w tych warunkach stwierdzono, że ponad 93% zdarzeń pozytywnego znakowania miało charakter klonalny.
Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić mikroiniekcje pojedynczych komórek embrionów kurzych podczas realizacji tej procedury. Należy pamiętać o rozcieńczeniu dużej ilości zapasowego plazmidu do optymalnego stężenia dla infekcji pojedynczych komórek, a następnie stosowaniu go w trakcie wszystkich eksperymentów. To wszystko.
Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w Państwa eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano metodę wstrzykiwania plazmidowego DNA do pojedynczych komórek somytów lub cewek nerwowych kurczaka przy użyciu mikropipet z cienką końcówką. Celem jest stworzenie klonalnych populacji transfected komórek wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Inżynieria genetyczna
Wstęp
- Techniki mikrowstrzykiwania są niezbędne do badania funkcji genów.
- Zarodki kurczaka są powszechnie stosowane jako organizm modelowy.
- Plazmidowe DNA może być wykorzystane do ekspresji białek fluorescencyjnych w celu wizualizacji.
- Transfekcja pojedynczych komórek umożliwia analizę klonalnych populacji komórek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody wstrzykiwania plazmidowego DNA do konkretnych tkanek.
- Wygenerowanie pojedynczych komórek ztransfectedowanych do dalszych badań.
- Umożliwienie obserwacji ekspresji genów w żywych embrionach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pipet do mikroiniekcji o odpowiednich średnicach końcówek.
- Przygotowanie roztworów zapasowych plazmidów do iniekcji.
- Przygotowanie zarodków kurzych do mikroiniekcji.
- Iniekcja plazmidowego DNA do somytów lub cewek neuralnych.
Główne wyniki
- Skuteczne wstrzyknięcie plazmidowego DNA do docelowych tkanek.
- Wygenerowanie pojedynczych transfektowanych komórek, które rozwijają się w populacje klonalne.
- Wizualizacja ekspresji genów za pomocą zielonego białka fluorescencyjnego.
- Opracowanie protokołu dla przyszłych badań nad funkcją genów.
Wnioski
- Technika mikrowstrzykiwania jest skuteczna w przypadku transfekcji pojedynczych komórek.
- Metodę tę można zastosować w różnych badaniach z zakresu biologii rozwoju.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach, aby zgłębić funkcję genów in vivo.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Transfekcja pojedynczych komórek w embrionach kurczaka umożliwia precyzyjne śledzenie linii komórkowych oraz manipulacje genetyczne, wspierając walidację celów w szlakach rozwojowych. Metoda ta pozwala na ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zachowania komórek progenitorowych z efektami fenotypowymi, co dostarcza istotnych informacji na etapie wczesnego odkrywania leków. Jej powtarzalność oraz ilościowa analiza klonalna zwiększają pewność prognostyczną w przedklinicznych systemach modelowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez śledzenie potomstwa klonalnego z pojedynczych prekursorów w poddomenach somytów i cewy nerwowej.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację pochodnych typów komórek (np. skóry właściwej i mięśni) z oznakowanych prekursorów.
- Wartość strategiczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez porównywanie genetycznie zmodyfikowanych populacji klonalnych z kontrolami w celu oceny funkcjonalnej celu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez sporadyczną transfekcję pojedynczych komórek w określonych obszarach tkanek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki kontrolowanemu stężeniu plazmidów (0,05–0,1 µg/µl dla znakowania klonalnego) oraz spójnym parametrom mikroiniekcji.
- Wartość strategiczna: Zwiększa możliwości przesiewowe, umożliwiając skalowalne i kompatybilne z platformą śledzenie linii komórkowych w wielu segmentach embrionu (6–12 na embrion).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest spójna z systemami istotnymi dla schorzeń poprzez modelowanie dynamiki klonalnej w embriogenezie kręgowców, co ma znaczenie dla badań nad wadami wrodzonymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną za pomocą immunohistochemii i analizy seryjnych przekrojów segmentów poddanych transfekcji.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez ilościowe określenie wskaźników sukcesu klonalnego (~10% transfekcji, >93% klonalności wśród wyników pozytywnych) w celu zaplanowania skalowania eksperymentów.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje kontinuum odkryć – od testowania hipotez we wczesnej biologii, przez identyfikację związków wiodących za pomocą klonalnej analizy funkcjonalnej, aż po prace przedkliniczne poprzez podłużne śledzenie fenotypu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie śledzenia linii pojedynczych komórek progenitorowych w celu wyjaśnienia dywersyfikacji losów w liniach somytów i cewy nerwowej.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz dzięki powtarzalnemu przygotowaniu mikropipet (średnica końcówki 8–10 µm) i zestandaryzowanym protokołom wprowadzania DNA.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i skanowania przekrojów w celu pomiaru ekspansji klonalnej oraz wkładu pochodnych w czasie.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając porównanie manipulowanych populacji klonalnych z grupami kontrolnymi do trzech dni po iniekcji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako powtarzalna metoda w różnych badaniach dzięki zestandaryzowanym procesom przygotowania embrionów, kalibracji pipet i rozcieńczania plazmidów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w relacjach linii komórkowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność transfekcji pojedynczych komórek w różnych punktach czasowych rozwoju.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane biologiczne ryzyko na późnych etapach dzięki wczesnemu fenotypowaniu klonalnemu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, oparte na ilościowych metrykach pochodzenia klonalnego.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w wypalaniu mikropipet oraz w manipulowaniu zarodkami, aby uzyskać średnicę końcówki rzędu 8–10 µm i zapewnić skuteczną penetrację tkanki.
- Niezbędne instrumentarium obejmuje mikromanipulator, wstrzykiwacz pneumatyczny oraz mikroskop fluorescencyjny do śledzenia klonów.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga zastosowania spójnych rozcieńczeń plazmidów (np. 0,05–0,1 µg/µl) oraz protokołów określania stadium rozwoju zarodków w celu zapewnienia powtarzalności wskaźników transfekcji.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych obejmują dostosowanie ciśnienia wstrzykiwania i stężenia DNA w zależności od dostępności tkanki i geometrii zarodka.
- Ograniczenia praktyczne obejmują niską wydajność transfekcji (~10%), co wymaga rozcieńczania roztworów zapasowych i powtarzania wstrzyknięć w celu uzyskania rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek.
