Analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej Helios

Niniejsza procedura bada in vivo oddziaływania białko-białko pomiędzy dwoma regulatorami transkrypcji Arabidopsis, SEU (skrót od SEUS) oraz LUH (skrót od LUHOLOG). Wykorzystując biomolekularną komplementację fluorescencji, SEU jest fuzją z fragmentem N-końcowym żółtego białka fluorescencyjnego (YFP), a LUH jest fuzją z fragmentem C-końcowym YFP w obrębie DNA obu konstruktów plazmidowych. Konstrukty SEU-NYFP oraz LUH-CYFP są wprowadzane metodą bombardowania do komórek epidermy cebuli w celu przetestowania ich oddziaływania.

Interakcja między Seuss a LUH powoduje asocjację fragmentów terminalnych końcowych i C-terminalnych białka YFP w jądrach komórkowych, co prowadzi do fluorescencji YFP w jądrach. Po inkubacji przez 16 do 20 godzin w ciemności, łuski epidermy cebuli są obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu wizualizacji fluorescencji. Cześć, jestem Courtney Hollander z laboratorium dr. Zhi Lu z Katedry Biologii Komórki i Genetyki Molekularnej na University of Maryland.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę testowania interakcji białko-białko w komórkach cebuli przy użyciu mikrowstrzykiwacza genów BioRad Helios. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania interakcji białko-białko oraz lokalizacji białek w komórkach roślinnych. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wkłady do armatki genowej Helios zgodnie z protokołem JoVE opracowanym przez Woodsa i Zeto w 2008 roku, który szczegółowo demonstruje procedurę przygotowania wkładów dla każdej serii. 50 µg całkowitego plazmidowego DNA miesza się z 12,5 mg cząsteczek złota oraz roztworem PVP o stężeniu 0,5 mg/mL dla BIFC. Stosując tę samą metodę przygotowania wkładów, łączy się dwa plazmidowe DNA domniemanych oddziałujących białek: Seuss połączone z N-końcową połową YFP (w skrócie seus-NYFP) oraz LU Homolog połączony z C-końcową połową YFP (w skrócie L-U-H-C-Y-F-P).

Łączna ilość wynosi 50 µg na jedną partię, co pozwala na przygotowanie do 50 wkładów przy stężeniu 1 µg DNA na 0,25 mg złota w każdym wkładzie. Każdy wkład służy do jednego strzału. Po przygotowaniu wkładów należy je przetestować, aby sprawdzić, czy cząstki złota są efektywnie wyrzucane.

Owiń kwadratowy kawałek parafilmu wokół szalki Petriego. Następnie ustaw ciśnienie helu w zakresie od 150 do 200 PSI i wystrzel nowo wykonane wkłady w kwadrat parafilmu. Zaobserwuj słabo widoczne złote cząsteczki na parafilmie.

Różne ilości cząstek złota mogą zostać wstrzyknięte na próbkę przy różnych ciśnieniach helu. Jeśli jednak nie stwierdzono istotnych różnic, do bombardowania należy wybrać niższe ciśnienie. Test ten wskazuje również obszar pokryty przez każdy pojedynczy strzał.

Aby przygotować tkanki cebuli, należy zdjąć zewnętrzną skórkę z dużej żółtej cebuli, używając czystej i ostrej żyletki. Wyciąć prostokątny obszar o wymiarach 2×8 cm, obejmujący od czterech do pięciu warstw. Wyjąć prostokątny fragment tkanki cebuli i odrzucić dwie zewnętrzne warstwy.

Pozostałe warstwy cebuli pokrój na kawałki o boku około 1,5 cm. Kawałki cebuli umieść w szalce Petriego zawierającej krążki z papieru filtrowanego o średnicy 3 mm. Zwilż szalkę Petriego sterylną wodą i przykryj ją.

Kawałki cebuli są gotowe do bombardowania. Najpierw należy umieścić wkłady w białych, okrągłych uchwytach; do poszczególnych uchwytów należy włożyć wkłady zawierające różne konstrukty plazmidowe. Każdy uchwyt może pomieścić do 12 wkładów, co pozwala na wykonanie 12 strzałów.

W tym miejscu ładowane są trzy różne uchwyty. Pierwszy uchwyt zawiera wkłady z 35 S-G-F-P-A, silnym i konstytutywnym promotorem pochodzącym z wirusa mozaiki kapusty. Plazmid ten służy jako kontrola dodatnia.

Drugi uchwyt wypełnia się wkładami eksperymentalnymi zawierającymi równą ilość S-E-U-N-Y-F-P oraz L-U-H-C-Y-F-P. Trzeci uchwyt wypełnia się wkładami zawierającymi równomolową mieszaninę wektora puck spine oraz LUH puck spice. Służy to również jako kontrola negatywna.

Włóż baterię oraz nową wkładkę lufy do armatki genowej Helios. Upewnij się, że zarówno wkładka lufy, jak i armatka mają zamontowane odpowiednie pierścienie O-ring. Następnie włóż do armatki genowej pusty uchwyt kasety w taki sposób, aby oznaczenie numer 12 na uchwycie było skierowane ku górze armatki.

Przesuń uchwyt wkładu raz lub dwa razy, aby upewnić się, że został prawidłowo włożony. Następnie podłącz pistolet do butli z helem i ustaw ciśnienie w zakresie od 150 do 200 PS. Zakładam ochronniki słuchu i oddaję kilka strzałów, przytrzymując boczny przycisk podczas naciskania spustu. Strzelanie z pustym uchwytem wkładu oczyszcza komorę pistoletu i zapewnia stabilne ciśnienie.

Przed wystrzeleniem DNA, wystrzelenie fragmentu cebuli może służyć jako kontrola negatywna dla fluorescencji tła. Aby wystrzelić nanocząsteczki złota pokryte DNA, wyjmij pusty uchwyt kaset i włóż pierwszy załadowany uchwyt kaset zawierający kontrolę pozytywną. Przesuń uchwyt kaset tak, aby kaseta przeznaczona do wystrzału znajdowała się na dole uchwytu kaset.

Teraz należy umieścić kawałki cebuli na środku pustej szalki Petriego, tak aby wewnętrzna warstwa cebuli była skierowana do góry. Oprzyj osłonę lufy armatki genowej o szalkę Petriego i oddaj strzał. Przejdź do następowego wkładu i ostrzelaj inny kawałek cebuli.

Powtarzaj ten krok, aż zostanie wystrzelonych od czterech do pięciu fragmentów cebuli. Każdy fragment cebuli należy wystrzelić tylko raz. Przenieś ostrzelony fragment cebuli do szalki Petriego zawierającej wilgotny papier filtracyjny o grubości 3 mm w celu inkubacji wystrzelonych kartridży eksperymentalnych.

Zmień kartridż na Holden. Po drugie, pamiętaj o wymianie wkładki lufy, aby zapobiec kontaminacji. Wystrzel cztery do pięciu kawałków cebuli, tak jak pokazano przed chwilą, dla kontroli pozytywnej.

Następnie zmień kasetę na Holden. Numer trzy, zawierającą ujemną kontrolę DNA. I ponownie wprowadź cztery do pięciu fragmentów cebuli.

Wymień wkładkę lufy, aby zapobiec kontaminacji. Po bombardowaniu przykryj pokrywkami szalki Petriego zawierające kawałki cebuli.

Owiń je parafilmem, aby zapobiec wysychaniu. Inkubuj kawałki cebuli w temperaturze pokojowej w ciemności przez 16 do 48 godzin. Po zakończeniu bombardowania wyłącz gaz i zwolnij ciśnienie przed odłączeniem armatki genowej od butli z helem, odkręć wkładkę lufy, a następnie wyjmij uchwyt kaset oraz zużyte kasety.

Na koniec należy wyczyścić uchwyty kolumnek oraz wkładki tłoka, zanurzając je w zlewce z wodą z mydłem i poddając sonikacji przez 20 minut. Następnie należy opłukać je wodą, aby usunąć wszystkie pozostałości mydła.

Namoczyć w 70% etanolu przez godzinę, a następnie osuszyć na ręcznikach papierowych. Przystąpić do obserwacji fragmentów cebuli od 16 do 20 godzin po bombardowaniu. Po inkubowaniu bombardowanych fragmentów cebuli przez 16 do 20 godzin w temperaturze pokojowej, użyć pęsety z płaskimi końcami, aby powoli oddzielić pojedynczą warstwę komórek z wewnętrznej epidermy cebuli.

Jest to warstwa, która podczas bombardowania znajduje się bezpośrednio naprzeciw pistoletu. Umieść odwarstwioną warstwę w kropli wody na szkiełku podstawowym, a następnie przykryj ją szkiełkiem nakrywką. Należy przy tym zachować ostrożność, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza.

Obserwuj fluorescencję GFP lub YFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, takiego jak przedstawiony tutaj Zeiss Axio Observer Z1, korzystając z pola jasnego mikroskopu. Najpierw sprawdź występowanie cyklozy w cytoplazmie, aby upewnić się, że komórki są żywe. Aby to zrobić.

Naświetlaj preparat światłem w polu jasnym przez kilka minut, aby ogrzać tkankę cebuli, a następnie poszukaj ruchomych plastyd. Strumieniowanie cytoplazmatyczne nie zawsze jest łatwe do zaobserwowania, dlatego nie zrażaj się, jeśli nie będzie ono wyraźnie widoczne. Do detekcji fluorescencji użyj odpowiednich filtrów wzbudzenia i detekcji dla GFP lub YFP. Sprawdź również kontrole negatywne, którymi są fragmenty cebuli zaszczepione niefluorescencyjnym plazmidem.

Słabe żółte sygnały mogą pochodzić z uszkodzonych komórek, debris oraz cebul. Należy również sprawdzić kontrole pozytywne. Plazmid zawierający konstytutywnie ekspresowany reporter fluorescencyjny.

Fluorescencja GFP jest widoczna w niektórych, ale nie we wszystkich komórkach. Pęcherzyki powietrza mogą również generować fluorescencję tła. Widoczne sygnały GFP z komórek epidermy cebuli wskazują, że kasety, tkanki cebuli oraz strzelanie z armatki genowej zostały prawidłowo przygotowane i wykonane.

Przedstawiono tutaj silną fluorescencję obserwowaną w plazmidzie pozytywnym 35 SGFP. Silna fluorescencja jest widoczna w całej komórce, obejmując zarówno jądro, jak i cytoplazmę. Obraz w świetle przechodzącym pozwala dostrzec odpowiadające im zarysy komórek i jąder.

Nie każda komórka ulega transformacji. Sygnał fluorescencyjny YFP jest wykrywany w jądrze komórkowym cebuli, gdy kombinacja eksperymentalna Seuss, NYFP oraz L-U-H-C-Y-F-P zostanie wprowadzona do komórek cebuli metodą bombardowania, co wskazuje, że Seuss NYFP i L-U-H-C-Y-F-P oddziałują in vivo. Jednakże fluorescencja wynikająca z tej interakcji jest znacznie słabsza niż fluorescencja wywołana przez 35 SGFP w kontroli pozytywnej.

Ponadto czynniki transkrypcyjne SEUS i LUH lokalizują się w jądrach komórkowych. W związku z tym fluorescencja YFP jest obserwowana wyłącznie w jądrze. Co więcej, liczba komórek fluorescencyjnych jest znacznie niższa niż w przypadku dodatniej kontroli 35 SGFP.

Dzieje się tak, ponieważ B FFC działa tylko wtedy, gdy oba plazmidy partnerskie są ekspresowane w tych samych komórkach cebuli. W cebulach bombardowanych za pomocą uchwytu wkładu numer trzy, zawierającego mieszankę kolców, wektora i L-U-H-C-Y-F-P, nie wykryto sygnału fluorescencyjnego, co jest zgodne z oczekiwaniami dla kontroli negatywnej. Przedstawiliśmy właśnie sposób bombardowania komórek cebuli w celu badania oddziaływań białko-białko przy użyciu systemu gene gun BioRad Helios.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zastosowaniu odpowiednich kontroli pozytywnych i negatywnych oraz świadomość, że fluorescencja BIFC może charakteryzować się słabszym sygnałem i mniejszą liczbą komórek fluorescencyjnych. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.