Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Celem tego eksperymentu jest określenie, czy dwa białka oddziałują ze sobą w komórkach, oraz opisanie aspektów miejsc tej interakcji. W pierwszej kolejności komórki są transfektowane konstruktami ekspresyjnymi kodującymi dwa badane białka, z których jedno jest połączone z końcem N pofragmentowanego białka fluorescencyjnego, a drugie z komplementarnym końcem C pofragmentowanego białka fluorescencyjnego. Po umożliwieniu transfektowanym komórkom wykształcenia sygnału fluorescencyjnego w hodowli, kompleksy białkowe są wizualizowane za pomocą obrazowania i immunoblottingu.

Następnie zebrane obrazy są eksportowane do oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J, w celu określenia średniej intensywności fluorescencji na komórkę. W kontrolowanym eksperymencie wyniki BIFC mogą wykazać interakcje białko-białko oraz lokalizację tych kompleksów, na przykład w przypadku przecinania się domen SH3 białka rusztowującego i domeny bogatej w prolinę PI3KC2β. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kolokalizacja, immunoprecypitacja i FRET, jest to, że BIFC pozwala na przestrzenną lokalizację słabszych, przejściowych interakcji w komórce. Metoda ta nie wymaga również rozległego post-processingu obrazów, co ma miejsce w przypadku FRET.

Niniejsza metoda pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu transdukcji sygnału, takie jak: czy białka X i Y oddziałują ze sobą, a jeśli tak, to w których konkretnie przedziałach komórkowych lokalizują się te kompleksy? Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności wynikające z niewłaściwego doboru konfiguracji ekspresji swoich konstruktów. Białka docelowe z etykietą: rozpocznij od wyboru jednego z wielu fluoroforów dla białek fuzyjnych w technice BIFC.

Przyjmijmy, że końce aminowy i karboksylowy białka Venus są w stanie utworzyć kompleks w temperaturze 37°C, podczas gdy fragmenty Y-F-P-B-I-F-C wymagają wstępnej inkubacji w temperaturze 30°C. Zaprojektuj wektory ekspresyjne do dodania znaczników do białek zainteresowania, biorąc pod uwagę, w jaki sposób przyłączenie fragmentów BIFC może wpłynąć na funkcję tych białek. Na przykład białka z rodziny RAs oraz GTPazy są modyfikowane lipidowo na końcu karboksylowym i nie mogą być znakowane na tym końcu, aby nie zakłócić tej modyfikacji.

Zawsze należy przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu ustalenia warunków transfekcji. Należy również monitorować komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić optymalny czas rozwoju sygnału. Następnie należy wykonać analizę western blot, aby potwierdzić równą ekspresję konstruktów.

Ważne jest przeprowadzenie barwienia immunocytochemicznego na znacznik HA lub flag, aby zweryfikować, czy dodanie fragmentów BIFC nie zmienia lokalizacji komórkowej białek zainteresowania dla każdej płytki z próbkami. Wysiać 1,3 × 10⁵ komórek na każdą szklaną płytkę do hodowli oraz do dwóch studni płytki 6-dołkowej i pozostawić komórki do osadzenia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Następnego dnia przygotować DNA do transfekcji metodą lipofekcji lub inną preferowaną metodą.

W pierwszej kolejności rozcieńcz DNA w 250 µL bezsurowiczego DMEM, który będzie służył jako kontrola transfekcji. Dodaj CFP w stosunku 1:50 w odniesieniu do całkowitej ilości DNA BIFC. Następnie rozcieńcz lipofekcyjną mieszaninę w 250 µL bezsurowiczego DMEM, stosując 10 µL lipofekcjanta na 1 µg DNA.

Wymieszać rozcieńczenia DNA i lipidów, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przepłukać komórki dwukrotnie ciepłym medium DMEM bez surowicy. Dodać 2 ml medium DMEM bez surowicy do każdej płytki z szklanym dnem lub do każdego dołka płytki 6-dołkowej.

Następnie podziel każdą mieszaninę do transfekcji równomiernie pomiędzy jedną szalkę z dnem szklanym a dwa dołki płytki sześciodołkowej i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez pięć godzin. Na koniec usuń medium do transfekcji i zastąp je kompletnym medium DMEM z dodatkiem 10% FBS.

Inkubować komórki przez czas określony w badaniach pilotażowych, aby uzyskać wymagany poziom ekspresji interesujących białek. Zbadać transfekowane komórki pod mikroskopem epifluorescencyjnym, aby upewnić się, że kontrola pozytywna wykazuje fluorescencję. Przepłukać komórki trzy razy PBS w celu obrazowania żywych komórek.

Przenieś komórki do pożywki pozbawionej barwników wskaźnikowych. W przypadku obrazowania utrwalonych komórek dodaj 2% paraformaldehydu i inkubuj w lodzie przez 10 minut.

Następnie trzykrotnie wypłucz komórki PBS, po czym pokryj je 1 mL PBS i przechowuj w ciemności w temperaturze 4 °C, a następnie natychmiast poddaj komórki w płytce 6-dołkowej lizie. W przypadku analiz Western blot ważne jest, aby wszystkie komórki były przygotowane w tym samym czasie, tak aby zlizowane komórki były reprezentatywne dla komórek obrazowanych. Wykonaj Western blot, aby upewnić się, że białka z tagiem są ekspresowane na równym poziomie.

Podczas obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego ważne jest zachowanie stałych ustawień przez cały czas trwania eksperymentu, aby fluorescencja była porównywalna pomiędzy próbkami. Należy upewnić się, że obrazowane pojedyncze komórki nie wykazują nasycenia pikseli. Ponieważ CFP został zastosowany jako kontrola transfekcji, do analizy sygnałów BIFC należy wybierać wyłącznie komórki CFP-dodatnie.

Ilościowo określ fluorescencję przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ. Otwórz pliki obrazów w programie ImageJ. Przejdź do Analyze i wybierz Set Measurements. W oknie pomiarów zaznacz pola Area oraz Mean Gray Value. Zauważ, że w tym przykładzie obrazy żył zostały sztucznie pokolorowane na zielono, a obrazy CFP na czerwono.

Używając narzędzia zaznaczania wolną ręką, obrysuj krawędź całej komórki w kanale CFP, pozostawiając ten obrys na miejscu. Przełącz się na kanał YFP. Przejdź do analizy i zmierz średnią wartość szarości, która odzwierciedla średnią intensywność fluorescencji na komórkę dla każdego obrazu.

Narysuj okrąg w kanale YFP w obszarze, który nie zawiera komórki. Wykonaj pomiar dla tego obszaru jako tła. Odejmij tło od każdego obrazu.

W końcu, aby obliczyć średnią intensywność fluorescencji dla populacji komórek, należy wyciągnąć średnią z wartości średniego stopnia pomniejszonej o tło dla wszystkich komórek obrazowanych w jednej próbce. Idealnie należy poddać kwantyfikacji 60 komórek w trzech eksperymentach. Wielodomenowe białko rusztowaniowe intersecting reguluje przeżywalność neuronów poprzez regulację nowej klasy drugiej kinazy PI3K, PI3K C2β. Domeny SH3 białka intersecting oddziałują z regionem bogatym w prolinę na końcu aminowym PI3K C2β. Transfekcja VN-tagged intersecting oraz VC-tagged PI3K C2β skutkuje sygnałem fluorescencyjnym w kanale YFP, który został zabarwiony pseudokolorem zielonym, co wskazuje na tworzenie kompleksu.

CFP, tutaj sztucznie zabarwiony na czerwono, służy jako kontrola do znakowania przetransformowanych komórek; mutacje w domenie bogatej w prolinę białka PI3K2β, które zaburzają współwytrącanie interaktora i PI3K2β, zmniejszają sygnał BIFC. Ta różnica w sygnale BIFC nie wynika z różnic w ekspresji białek typu dzikiego i zmutowanych białek PI3K. Po opanowaniu technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu odpowiednich kontroli oraz sprawdzeniu ekspresji białek, aby upewnić się, że różnice w sygnale BIFC wynikają z różnic w tworzeniu kompleksów, a nie z różnic w ekspresji po zastosowaniu opisanej procedury.

Można zastosować inne techniki, takie jak rezonans plazmonowy powierzchniowy, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, jakie są różnice w powinowactwie tych kompleksów względem siebie.