Wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
1 lipca 2010
W niniejszym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej z wykorzystaniem elektroporacji oraz późniejszą detekcję i wizualizację sfuzowanych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Elektrofuzja polega na przykładaniu krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu do komórek znajdujących się w bliskim kontakcie. W tym filmie prezentujemy elektrofuzję komórek in vitro z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody adhezyjnej (Adherence Method). Eksperymenty przeprowadzono na liniach komórkowych czerniaka mysiego, BF1.
W celu przeprowadzenia eksperymentu należy wykonać następujące kroki. Hodować komórki w dwóch oddzielnych kolbach hodowlanych do osiągnięcia 80% konfluencji. Następnie dodać oddzielnie 2.1 µL każdego z roztworów stokowych.
10 milimolarne C-M-F-D-A lub odpowiednio CMRA do trzech mililitrów buforu Krebsa-Hessa w probówce wirówkowej. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem Krebsa-Hessa, a następnie wprowadzić roztwory ładujące do kolb. Roztwory ładujące zawierają odpowiednio około siedem mikromolarne C-M-F-D-A lub CMRA.
Inkubować komórki przez 30 minut w kontrolowanej atmosferze. Podczas tej pierwszej inkubacji regiony swobodnie przenikają przez błony komórkowe do cytozolu, gdzie przekształcają się w produkty reakcji przenikające przez błonę IMP. Po tej pierwszej inkubacji wypłukać, a następnie inkubować komórki w pożywce hodowlanej przez kolejne dwie godziny.
Komórki obserwuje się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Należy ustawić długość fali wzbudzenia na 548 nanometrów i wybrać odpowiedni filtr pasmowy dla obrazu fluorescencji komórek obciążonych CMRA; dla komórek obciążonych C-M-F-D-A należy ustawić długość fali wzbudzenia na 492 nanometrów i wybrać filtr pasmowy dla zielonej fluorescencji. Należy zliczyć komórki w obu kolbach, a następnie zmieszać komórki czerwone i zielone w stosunku 1:1, dostosowując stężenie komórek do 5 milionów komórek per mililitr.
Nanieś kroplę 20 µL zawiesiny komórek na środek każdego dołka. W 24-dołkowej płytce inkubuj komórki w kontrolowanej atmosferze przez 20 minut, aby umożliwić im lekkie przytwierdzenie do powierzchni dołka w formie monowarstwy i nawiązanie kontaktów międzykomórkowych. Umieść płytkę z komórkami na stoliku mikroskopu.
Umieść elektrody na dnie studzienki i podłącz je do generatora impulsów. Aby uzyskać optymalną elektrofuzję i zachować żywotność komórek, należy zastosować odpowiednie parametry impulsów elektrycznych. Parametry te zależą od linii komórkowej i powinny zostać określone w eksperymentach wstępnych. Usuń medium hodowlane i przemyj komórki jednym mililitrem buforu fosforanowego ISO omu, a następnie 350 µL buforu fosforanowego hypos Miller, aby wywołać obrzęk komórek.
Pozostaw komórki w buforze hiperosmolarnym przez dwie minuty przed zastosowaniem impulsów elektrycznych. Impulsy elektryczne powinny zostać przyłożone, gdy komórki osiągną objętość bliską maksymalnej, tj. zanim rozpocznie się regulacja objętości.
Spadek w naszym eksperymencie. Zastosowano serię ośmiu impulsów prostokątnych o czasie trwania 100 mikrosekund przy częstotliwości 1 herca. Po podaniu impulsów.
Pozostaw komórki w spokoju na 10 minut. Wyznacz wydajność dyfuzji za pomocą mikroskopu kontrastowego i fluorescencyjnego. Należy wykonać trzy obrazy: w kontraście fazowym oraz w fluorescencji czerwonej i zielonej w pięciu losowo wybranych polach widzenia.
W każdym przypadku, przy użyciu oprogramowania ImageJ, z każdej triplety obrazów utworzono obrazy trójekanałowe, aby poprawić ich jakość wizualną. Do oryginalnych obrazów zastosowano etapy wstępnego przetwarzania: odejmowanie tła oraz poprawę kontrastu z wykorzystaniem domyślnych zestawów parametrów. Na koniec, za pomocą wtyczki RGB to Gray w ImageJ, stworzono obrazy trójekanałowe. Na tak przygotowanym obrazie widoczna jest cytoplazma w stanie spoczynku wraz z błonami komórkowymi.
W ten sposób można łatwo określić liczbę niewielkiej ilości komórek w obrazie trójątkowym, zliczając wszystkie trzy typy komórek: czerwone, zielone oraz dwukrotnie fluorescencyjne. Wyznacz procent komórek dwukrotnie fluorescencyjnych, dzieląc ich liczbę przez całkowitą liczbę komórek w każdym obrazie. Wydajność fuzji definiuje się następnie jako procent komórek dwukrotnie fluorescencyjnych pomnożony przez dwa.
Ponieważ połowa komórek widzenia nie jest wykrywana, gdy komórki mają widoki tego samego koloru.
Przegląd
Niniejszy film prezentuje efektywną elektrofuzyjną fuzję komórek in vitro z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody adhezyjnej połączonej z elektroporacją. Proces obejmuje detekcję połączonych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Techniki fuzji komórek
- Metody elektroporacji
- Zastosowania mikroskopii fluorescencyjnej
Wstęp
- Elektrofuzja jest techniką, w której stosuje się impulsy elektryczne w celu ułatwienia fuzji komórek.
- Metoda ta pozwala zwiększyć wydajność tworzenia hybryd komórkowych.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację połączonych komórek.
- Zrozumienie fuzji komórek jest kluczowe dla wielu zastosowań biologicznych.
Cel badania
- Zaprezentowanie niezawodnej metody elektrofuzji komórek.
- Wizualizacja i ilościowa ocena wydajności fuzji komórek.
- Przedstawienie protokołu, który może zostać zreplikowany w innych laboratoriach.
Zastosowane metody
- Hodowano komórki czerniaka mysiego i przygotowywano je do fuzji.
- Przed fuzją do znakowania komórek wykorzystano barwniki fluorescencyjne.
- W celu indukcji fuzji komórek zastosowano impulsy elektryczne.
- Do analizy wyników fuzji wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną.
Główne wyniki
- Pomyślną fuzję komórek potwierdzono za pomocą fluorescencji.
- Obliczono odsetek komórek wykazujących podwójną fluorescencję w celu określenia wydajności fuzji.
- Zidentyfikowano optymalne parametry impulsu elektrycznego zapewniające żywotność komórek.
- Jakość wizualną obrazów poprawiono za pomocą technik przetwarzania obrazu.
Wnioski
- Zmodyfikowana metoda adhezji jest skuteczna w przypadku elektrofuzji komórek.
- Mikroskopia fluorescencyjna stanowi cenne narzędzie do oceny wydajności fuzji.
- Niniejszy protokół może zostać dostosowany do różnych typów komórek stosowanych w badaniach.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektrofuzja komórek wizualizowana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej stanowi niewirusową i niechemiczną platformę do generowania komórek hybrydowych, wspierając wczesne etapy badań biofarmaceutycznych. Ilościowa wizualizacja zdarzeń fuzji umożliwia rzetelną ocenę technik manipulacji komórkowych, co ma bezpośredni wpływ na walidację celów oraz opracowywanie testów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w przepływach pracy opartych na komórkach i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych uwzględniających ryzyko.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów fuzji komórkowej istotnych dla testowania hipotez terapeutycznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację strategii manipulacji komórkami w celu generowania komórek hybrydowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowe określanie wydajności i specyficzności fuzji.
- Zapewnia mierzalne wyniki niezbędne do selekcji projektów w portfolio oraz oceny pewności w odniesieniu do celów terapeutycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy komórkowe do dalszego przesiewania fenotypów zależnych od fuzji.
- Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny pomiar ilościowy wydajności fuzji za pomocą podwójnej fluorescencji.
- Umożliwia skalowalność testu i ponowne wykorzystanie platformy do oceny związków ukierunkowanych na procesy fuzji komórkowej.
- Wspiera rzetelne porównawcze zestawienie protokołów fuzji dla różnych typów komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera procesy translacyjne poprzez umożliwienie generowania hybrydowych komórek do modelowania przedklinicznego.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną terapii opartych na komórkach.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną w strategiach manipulacji komórkami w celu rozwoju terapii.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie koncepcji terapeutycznych opartych na fuzji komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając rzetelną kwantyfikację i wizualizację fuzji komórek, co wspiera zarówno wczesną walidację, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Ilościowy pomiar wydajności fuzji wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Podwójne odczyty fluorescencyjne umożliwiają odtwarzalną optymalizację testów i wyznaczanie punktów odniesienia.
- Analityka: Kwantyfikacja oparta na obrazowaniu zapewnia obiektywne i porównywalne wyniki do oceny warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Generowanie hybrydowych komórek wspiera modelowanie przedkliniczne i dopasowanie biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Przepływ pracy jest adaptowalny dla różnych typów komórek i programów badawczych, co zwiększa wartość platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w procesach fuzji komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ilościowe oznaczanie fuzji i wspiera powtarzalność wyników w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz poprawia efektywność kapitałową w programach na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację strategii terapeutycznych opartych na komórkach z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w hodowli komórkowej, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizie obrazu.
- Niezbędny jest dostęp do generatorów impulsów, mikroskopów fluorescencyjnych i oprogramowania do przetwarzania obrazów.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów znakowania, obrazowania i kwantyfikacji pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do różnych linii komórkowych może wymagać optymalizacji parametrów impulsów i warunków znakowania.
- Wydajność fuzji oraz żywotność komórek zależą od linii komórkowej i muszą zostać określone empirycznie.
