Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie białek fluorescencyjnych M orange i two andron do dwuprobowej optycznej wyróżniarki w celu selektywnego znakowania czterech oddzielnych populacji komórek lub przedziałów komórkowych. Osiąga się to poprzez najpierw naświetlanie komórek światłem wzbudzającym o niskiej intensywności o długości fali 488 nanometr, aby wyłączyć całą zieloną fluorescencję drawn per. W drugim kroku komórki poddaje się działaniu światła wzbudzającego o długości fali 488 nanometr o wysokiej intensywności, co powoduje fotokonwersję fluorescencji m orange na czerwoną.

Następnie komórki poddaje się dwufotonowej ekscytacji o długości fali 800 nm w celu aktywacji fluorescencji dral. Ponownie uzyskano wyniki wykazujące, że możliwe jest znakowanie komórek w czterech odrębnych kombinacjach w oparciu o optyczne wyróżnienie za pomocą podwójnej sondy z M Orange two i drawn ppa. Główną zaletą tej procedury w stosunku do istniejących metod, takich jak frakcjonowanie subkomórkowe, jest to, że jest ona przeprowadzana na żywych komórkach.

Niniejsza procedura może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek beta, takie jak powód, dla którego wydzielana jest tylko niewielka frakcja pęcherzyków z insuliną. Choć procedura ta pozwala na zgłębienie funkcji komórek beta, może ona zostać zastosowana również w innych układach, na przykład do śledzenia komórek nowotworowych in vivo. Próbka kropel białka fluorescencyjnego składa się z emulsji wodnej w układzie oktalnym, w której faza wodna zawiera białko fluorescencyjne.

Emulsję tę umieszcza się pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a kwadratowym szkiełkiem nakrywkowym o boku 22 mm do zastosowań mikroskopowych. Przed rozpoczęciem tej procedury szkiełka przedmiotowe i nakrywki muszą zostać oczyszczone i pokryte środkiem hydrofobowym. Szkło należy oczyścić, myjąc je przez pięć minut w acetonie.

Po myciu pozostaw szkło do wyschnięcia na powietrzu. Następnie przygotuj 2% roztwór metylotrimetoksysilanu w acetonie i zanurz w nim szkło na dwie minuty. Po pokryciu wyjąć szkło z roztworu i pozwolić mu wyschnąć.

Następnie opłucz szklane naczynia 70% ethanolem z butelki z atomizerem. Po opłukaniu pozostaw szkło do ponownego wyschnięcia na powietrzu i usuń pozostałą ciecz. Po użyciu sprężonego powietrza powlekione szkło można przechowywać przez co najmniej jeden miesiąc.

Po przygotowaniu szkła laboratoryjnego należy pobrać białka fluorescencyjne, które zostały wcześniej oczyszczone jako białka z tagiem His z bakterii E. coli. Należy zmierzyć widmo absorbancji oczyszczonego białka. Następnie należy przygotować roztwór stokowy o gęstości optycznej wynoszącej około 0,1 w buforze Tris-saline o pH 8 zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej.

Dodatkowo, w 15 ml probówce stożkowej przygotuj 10 ml mieszaniny octanu i roztworu soli buforowanej triss w stosunku 1:1, a następnie wymieszaj energicznie. Po wymieszaniu odstaw mieszaninę do czasu całkowitego rozdzielenia faz. Górna faza to octan; aby przygotować emulsję, pipetuj 45 µL octanu i 5 µL białka fluorescencyjnego do probówki typu Eppendorf.

Kilkakrotnie stuknij probówkę, aby rozpocząć tworzenie emulsji, a następnie poddaj ją sonikacji przez 30 sekund w kąpieli ultradźwiękowej. W międzyczasie przygotuj powleczone szkiełko przedmiotowe i szkiełko nakrywkowe do użycia po sonikacji. Emulsja powinna stać się całkowicie mętna.

Natychmiast nanieś pipetą 4 µL emulsji z części środkowej probówki na powlekone szkiełko przedmiotowe i przykryj je powlekanym szkiełkiem nakrywką. Emulsja powinna równomiernie rozprzestrzenić się między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką. Próbka powinna ustabilizować się w ciągu kilku minut.

Poniższa procedura przedstawia ogólną strategię przygotowania eksperymentu fotokonwersji białek fluorescencyjnych z wykorzystaniem konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Procedurę tę można zastosować zarówno w przypadku białek oczyszczonych, jak i żywych komórek. W niniejszym eksperymencie, jako ogólny punkt wyjścia dla procesu fotokonwersji, wykorzystano próbkę w postaci kropli zawierającej oczyszczone białko m orange two.

Skonfiguruj konfokalny skaningowy mikroskop laserowy w następujący sposób. Użyj obiektywu imersyjnego olejowego 40x o aperturze numerycznej 1,3 oraz rozmiaru obrazu 512 na 512 pikseli. Ustaw czas przebywania wiązki na piksel na 6 µs podczas skanowania, powiększenie (zoom) na 4 i zwiększ otwór pinhole tak, aby odpowiadał rozdzielczości w osi Z wynoszącej 3 µm.

Skonfiguruj dwa kanały detekcji dla fluorescencji początkowej i po fotokonwersji, a także kanał fotokonwersji. Obserwuj formę pomarańczową, wykorzystując światło wzbudzenia o długości 561 nanometrów, i zbieraj fluorescencję w zakresie od 570 do 630 nanometrów. Wykrywaj formę czerwoną po fotokonwersji, wykorzystując światło wzbudzenia o długości 633 nanometrów, i zbieraj fluorescencję w zakresie od 640 do 700 nanometrów.

W kanale fotokonwersji należy wybrać linię lasera 488 nm i zbierać fluorescencję w zakresie od 490 do 540 nm. Kanał fotokonwersji nie jest ściśle wymagany, ale może być pomocny. Aby rozpocząć eksperyment, należy użyć kanału detektora do obrazowania początkowej fluorescencji przy ciągłym skanowaniu, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu.

Następnie aktywuj kanał fotokonwersji i wybierz niską moc lasera. Rozpocznij obrazowanie serii time-lapse i stopniowo zwiększaj moc lasera do fotokonwersji, aż do zaobserwowania znacznego wygaszenia początkowej fluorescencji. Kontynuuj skanowanie, dopóki początkowa fluorescencja nie zostanie wygaszona w około 75%.

Następnie dezaktywuj kanał konwersji fotochemicznej i aktywuj kanał detekcji fluorescencji po konwersji. Rozpocznij obrazowanie przy wysokim wzmocnieniu detektora i niskiej mocy lasera. Następnie stopniowo zwiększaj moc lasera, aż do momentu wykrycia fluorescencji po konwersji.

Po wykryciu sygnału należy dostosować moc lasera oraz detekcję lub wzmocnienie (gain) w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu. Na koniec należy zoptymalizować moc lasera wykorzystywanego do fotokonwersji, a także czas jego trwania. Zwiększenie mocy lasera przyspieszy tempo fotokonwersji.

Jednakże zbyt duża moc lasera spowoduje fotoblaknięcie białka. Po ustaleniu optymalnej konwersji fotochemicznej, mocy oraz czasu trwania naświetlania laserem, parametry te można wykorzystać do skonfigurowania standardowego modułu fotoblaknięcia lub modułu odzyskiwania fluorescencji po fotoblaknięciu. Wówczas kanał konwersji fotochemicznej nie będzie już wymagany ze względu na właściwości spektralne przesunięcia ku czerwieni M orange two.

Można go stosować w połączeniu z zielonym przełączalnym światłem białkiem fluorescencyjnym rysunku PU w celu podwójnego optycznego wyróżnienia sondy. Aby rozpocząć podwójne optyczne wyróżnianie sondy, należy hodować komórki HeLa w szalkach z matową szklaną podstawą, a następnie transfekować komórki plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne na 24 godziny przed obrazowaniem, stosując standardową transfekcję LIPECTOMY 2000.

Umieść żywe komórki w konfokalnym mikroskopie skaningowym i skonfiguruj go do fotokonwersji M orange two zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie skonfiguruj mikroskop do fotoprzełączania DPA. DPA jest wzbudzane światłem o długości 488 nanometrów, a jego fluorescencję można obrazować przy użyciu kanału fotokonwersji M orange two.

Należy zadbać o zminimalizowanie mocy lasera używanej do obrazowania MPA, ponieważ zbyt wysoka moc lasera spowoduje inaktywację mpa. Dodaj kanał dla fotoaktywacji MPA, wykorzystując dwufotonową ekscytację przy 800 nanometrach; następnie określ moc lasera wymaganą do obrazowania fotoaktywacji oraz fotoinaktywacji fluorescencji OFA.

Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest inaktywacja RPA bez fotokonwersji M orange, ponieważ oba te procesy zachodzą przy tej samej długości fali. Aby temu zapobiec, bardzo ważne jest dokładne zoptymalizowanie procesu fotokonwersji.

Moc i czas trwania impulsu lasera. Należy zachować ostrożność, ponieważ fotokonwersja mOrange2 oraz inaktywacja PU zachodzą podczas wzbudzania światłem o długości fali 488 nm; dąży się do inaktywacji PU bez znaczącej fotokonwersji mOrange2. Po ustaleniu parametrów fotokonwersji mOrange2 oraz fotoprzełączania DPA należy stosować niższą moc lasera.

Możliwe jest zastosowanie optycznego podkreślania za pomocą podwójnej sondy. Najpierw należy wygasić fluorescencję DPA w całym polu widzenia, stosując wzbudzanie falą o długości 488 nanometrów i niskiej mocy. Następnie należy wybrać obszar zainteresowania i przekształcić m orange two, stosując wzbudzanie falą o długości 488 nanometrów i wysokiej mocy.

Na koniec należy wybrać obszar zainteresowania i aktywować fluorescencję DPA, wykorzystując dwufotonową ekscytację o długości fali 800 nanometrów. Próbki kropli białka fluorescencyjnego są idealne do konfigurowania zastosowań fotokonwersji w mikroskopii konfokalnej. Gdy próbka kropli zostanie przygotowana prawidłowo, krople wydają się bardzo jednorodne.

Jednakże, gdy próbka jest przygotowywana bez nakładania szkiełka podstawowego i nakrywki, krople w przygotowanych próbkach mają tendencję do spłaszczania się przeciwko jednej z powierzchni szklanych. W przypadku braku 0,1% BSA białko fluorescencyjne wykazuje tendencję do gromadzenia się na jednym interfejsie woda-olej. Tworzenie halo konwersji fotonowej fluorescencji jest krytycznie zależne od mocy lasera oraz czasu naświetlania.

Zbyt duża moc lasera lub zbyt długi czas ekspozycji spowodują fotobleaching, co doprowadzi do zmniejszenia intensywności fotokonwertowanej fluorescencji czerwonej. Wyraźne właściwości spektralne mOrange2 i PHO umożliwiają podwójne optyczne wyróżnienie sond przed fotokonwersją; komórki wykazujące ekspresję mOrange2, histony H2B i DPA mito wykazują fluorescencję pomarańczową w jądrze oraz fluorescencję zieloną w mitochondriach. Gdy cała fluorescencja zostaje wyłączona przy niskiej mocy wzbudzenia 488 nm, fotokonwersja mOrange jest minimalna.

M orange two można następnie poddać fotokonwersji do koloru czerwonego przy użyciu wysokoenergetycznego wzbudzenia o długości fali 488 nanometrów. Po dokonaniu fotokonwersji M orange two, fluorescencję drawn puff można ponownie aktywować, stosując dwufotonowe wzbudzenie o długości fali 800 nanometrów. Dzięki optycznemu wyróżnianiu za pomocą podwójnej sondy komórki mogą być znakowane na cztery różne sposoby.

Dzięki zastosowaniu tej techniki możliwe jest specyficzne znakowanie czterech różnych populacji komórek. Jak zauważono, jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest inaktywacja MPA bez fotokonwersji m orange. Po opanowaniu tej metody można przeprowadzać dalsze eksperymenty z wykorzystaniem tego systemu, na przykład śledzenie wielu populacji w komórkach beta trzustki.

To wszystko. Mam nadzieję, że ta prezentacja okazała się przydatna. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.