Pomiar sztywności zginania komórek bakteryjnych z wykorzystaniem pułapki optycznej

Aby określić sztywność zginania pojedynczych komórek coli, najpierw należy wyhodować bakterie do fazy wykładniczej, a następnie przytwierdzić je do chemicznie traktowanej powierzchni szkiełka nakrywkowe. Pozostaw przytwierdzone do powierzchni komórki do dalszego wzrostu, tak aby rozwinęły elastyczne końce. Następnie wprowadź przepływem kulki dielektryczne, przechwyć jedną kulkę i przygnij ją do elastycznej końcówki komórki.

Ostatnim etapem procedury jest wygięcie komórki za pomocą pułapki optycznej i pomiar wynikających z tego danych dotyczących wymuszonego przemieszczenia. Sztywność zginania komórki można obliczyć, stosując dopasowanie liniowe do danych wymuszonego przemieszczenia. Cześć, jestem Steven Wong z laboratorium profesora Joshuy Shere'a w Instytucie Genomiki Integracyjnej Louisa Sicklera oraz w Katedrze Fizyki na Uniwersytecie Princeton.

Dzisiaj przedstawimy procedurę zginania pojedynczych komórek E. coli oraz pomiaru sztywności komórek. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać wpływ różnych struktur wewnątrzkomórkowych na integralność mechaniczną komórek bakteryjnych. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować 3 mL dowolnych komórek e coli w medium LB do fazy wykładniczej. Gdy komórki osiągną gęstość optyczną przy 600 nm w zakresie od 0,2 do 0,4, należy uzupełnić kulturę o 50 µg/mL cefaleksyny i inkubować przez 15 minut w celu indukcji wzrostu nitkowatego. W ciągu tych 15 minut należy przygotować komorę przepływową.

Przytwierdź dwa kawałki dwustronnej taśmy do szkiełka przedmiotowego w taki sposób, aby między nimi pozostała przerwa o szerokości 3 mm, a następnie przymocuj na górze szkiełko nakrywkowe. Przerwa między kawałkami taśmy tworzy kanał dla przepływającej cieczy. Pokryj szkiełko nakrywkowe PEI, wprowadzając za pomocą mikropipety 10 µL 1% polietylenoiminy rozpuszczonej w wodzie do komory przepływowej, a następnie inkubuj przez pięć minut.

Następnie przeprowadź płukanie, wprowadzając 200 µL wody z jednego końca komory i zbierając ją z drugiego końca za pomocą pompy próżniowej. Po 15 minutach hodowli bakterii w obecności cefaleksyny, odwirowuj jeden ml komórek w mikrocentry fudze i resuspenduj je w 200 µL LV z cefaleksyną. Następnie ponownie, używając mikropipety z jednej strony i próżni z drugiej, wprowadź 50 µL skoncentrowanej kultury komórek do komory zawierającej pokrywkę szkiełkami i inkubuj przez trzy minuty.

Następnie przemyć 50 µL pożywki Vel B uzupełnionej o cefaleksynę. Aby usunąć nieprzytwierdzone komórki, inkubować komorę w temperaturze 37 °C przez od 30 minut do jednej godziny, aby umożliwić wzrost przytwierdzonych komórek przed umieszczeniem ich w urządzeniu do pułapkowania optycznego podczas inkubacji. Przygotować koraliki powlekane polilizyną, inkubując 3 µL koralików polistyrenowych o średnicy 0,5 µm w 0,1% polilizynie rozcieńczonej w wodzie przez 30 minut.

Po zakończeniu inkubacji kulek, należy je wyprać trzykrotnie poprzez wirowanie w mikrocentry fudze i ponowne zawieszenie w 1 ml wody, a następnie przejść do wiązania kulek z bakteriami i pomiaru sztywności wiązania komórek. Najtrudniejszym elementem tego protokołu jest umiejętność zlokalizowania i rozpoznania odpowiedniej komórki do pomiarów sztywności zginania. Za odpowiednią uznaje się komórkę z wyraźnie określonym końcem przytwierdzonym oraz końcem wolnym.

W komorze przepływowej mikroskopu należy poszukać komórki z wyraźnie utrwalonym końcem. Niektóre komórki są przytwierdzone tylko jednym końcem, a siła zginająca działająca na drugi koniec powoduje obrót całej komórki zamiast jej zgięcia. Aby znaleźć odpowiednią komórkę, należy szybko zgiąć każdą z nich za pomocą pułapki, wykorzystując ruch stolika sterowany dżojstikiem.

Po znalezieniu odpowiedniej komórki, rozcieńczyć roztwór kulek dwukrotnie w pożywce LB z cefaleksyną, a następnie nanieść 30 µL roztworu kulek do komory przepływowej, pipetując go na jednym końcu i delikatnie usuwając nadmiar z drugiego końca za pomocą chusteczki Kimwipe. Za pomocą pułapki optycznej uchwycić pływającą kulkę i dotknąć nią wolnego końca komórki. Ponownie przemyć komórkę za pomocą mikropipety i chusteczki Kimwipe, używając 50 µL cefaleksyny w pożywce LB, aby usunąć nieprzyczepione kulki. Następnie uruchomić dedykowany program LabVIEW w celu przyłożenia sił zginających do komórki i zarejestrować dane dotyczące wymuszonego przemieszczenia.

Najpierw skalibruj odpowiedź detektora, wykonując skanowanie RA przyczepionego koralika w wiązce lasera detekcyjnego i rejestrując sygnały napięcia 3D PSD. Następnie określ oś długą komórki na obrazie mikroskopowym. Po wyznaczeniu długiej osi komórki, przesuwaj komórkę skokowo w kierunku prostopadłym do tej osi, rejestrując jednocześnie przebytą odległość oraz przemieszczenie koralika względem centrum pułapki optycznej.

Na koniec przekonwertuj wartości przemieszczenia na przyłożoną siłę, korzystając z wcześniej zmierzonej sztywności pułapki, i zapisz wyniki. Przemieszczenie końcówki oraz siła zapisane w pliku stanowią dane dotyczące wymuszonego przemieszczenia dla pojedynczej komórki. Nachylenie tej prostej odpowiada sztywności zginania komórki.

Właśnie pokazaliśmy, jak połączyć sztywność zginania bakterii E. coli z pułapką optyczną. Stosując tę procedurę, należy pamiętać o wybraniu odpowiedniej komórki z wyraźnie zdefiniowanym końcem unieruchomionym i końcem wolnym. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.