Podejście genetyki odwrotnej do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie, czy dwa geny są funkcjonalnie redundantne w procesie specyfikacji określonej linii komórkowej. Osiąga się to najpierw poprzez zdefiniowanie fenotypu utraty funkcji każdego z poszczególnych genów przy użyciu specyficznych dla genów morpholino wstrzykniętych do rozwijających się embrionów zebrafish. Drugim krokiem procedury jest opracowanie testu do ilościowej oceny specyfikacji lub różnicowania linii komórkowej.

Na przykład, wykorzystując linię ryb reporterowych, co zaprezentujemy w niniejszym materiale. Trzecim krokiem procedury jest połączenie dwóch FENO morph, aby jednocześnie uzyskać utratę funkcji obu genów. Ostatnim krokiem procedury jest ocena fenotypu wywołanego podwójnym wyciszeniem genów.

W rezultacie można uzyskać dane wykazujące utratę lub nabycie funkcji komórek danej linii poprzez badanie reportera linii lub analizę ekspresji markerów specyficznych dla linii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak łączenie knockoutów w modelu mysim, jest możliwość celowania w dwa lub nawet trzy geny w modelu rybim poprzez proste połączenie zwalidowanych morphino w jednym eksperymencie. Można wstrzyknąć ponad 100 embrionów i oceniać fenotypy w ciągu kilku dni.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania. W biologii rozwoju, na przykład przy definiowaniu ścieżek transkrypcyjnych kontrolujących los komórek, kluczowe szlaki regulacyjne są często reprezentowane przez małe rodziny spokrewnionych genów o redundantnych funkcjach. Ich rola nie jest zatem oczywista w badaniach nad mysimi nokautami ze względu na kompensację ze strony genów siostrzanych.

Choć model ten pozwala na uzyskanie wglądu w embriogenezę danio pręgowanego, wyniki można odnieść do innych systemów, takich jak mysz, ponieważ te same programy genetyczne są zazwyczaj dobrze zachowane w toku ewolucji. Przed wstrzyknięciem substancji do embrionów należy przygotować płytki do mikroiniekcji. Do odwróconej pokrywki szalki Petriego o średnicy 100 mm wlej około 12 ml 2% agros w wodzie systemowej, czyli czystej wodzie pobranej bezpośrednio z systemu akwariowego.

Umieść dwa szkiełka przedmiotowe pod kątem około 45 stopni w dwóch bokach pokrywki. Gdy agar stężeje, delikatnie odsuń szkiełka od pokrywki, tworząc rowki, w których zarodki będą spoczywać podczas wstrzykiwania morpholino. Roztwory morpholino przechowuje się w temperaturze pokojowej w stężeniu 1 mM w sterylnej, destylowanej wodzie dejonizowanej przed wstrzykiwaniem. Inkubuj zapasy morpholino w temperaturze 65 °C przez pięć minut, aby upewnić się, że są całkowicie rozpuszczone.

Pozostawć roztwory macierzyste do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Każdy nowo zaprojektowany morpholino musi zostać empirycznie zwalidowany pod kątem aktywności i tolerancji embrionalnej. W probówkach do mikrowirowania przygotować od jednego do dwóch rozcieńczeń seryjnych roztworu macierzystego morpholino w destylowanej wodzie dejonizowanej, aby uzyskać stężenia robocze wynoszące 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM i 0,125 mM.

Pod stereomikroskopem, za pomocą ssania, należy napełnić od przodu skalibrowaną igłę wtryskową, która została przymocowana do mikromanipulatora i odpowiednio ustawiona. Napełnij igłę około 1 µL roztworu morpho o najniższym stężeniu. Użyj pipety transferowej, aby przenieść zapłodnione embriony jednokomórkowe do wgłębień płytki do mikroiniekcji.

Za pomocą pipety usuń nadmiar wody z płytki, tak aby zarodki opadły na dno wgłębienia. Umieść płytkę do iniekcji pod mikroskopem, wprowadź igłę przez chorion do żółtka. Wykonaj iniekcję w każdy zarodek, a następnie wyjmij igłę i przesuń płytkę, aby uzyskać dostęp do kolejnego zarodka.

Podczas nauki wstrzykiwania pomocne może być zastosowanie barwnika witalnego w celu wizualizacji procesu wstrzykiwania do komórki, jak pokazano tutaj; następnie należy przenieść embriony z powrotem do 100 milimetrowej szalki Petriego z wodą systemową i inkubować je w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Należy usunąć pozostałą roztwór morpholino z igły, a następnie wypełnić ją kolejnym, wyższym stężeniem morpholino, aby wstrzyknąć je do następnej partii embrionów znajdujących się na odpowiednim etapie rozwoju. Następnie należy zbadać embriony pod kątem fenotypów przy każdym zastosowanym stężeniu morpholino.

Dawka progowa dla każdego morpho to najniższa dawka, przy której występuje określony, wiarygodny fenotyp. Może być konieczne przeprowadzenie wielu serii miareczkowania, aby precyzyjnie określić próg. W celu zbadania interakcji genetycznej pomiędzy dwoma różnymi genami.

Przygotować mieszaninę dwóch wybranych morphino zgodnie z ich odpowiednimi stężeniami progowymi. Należy pamiętać, że embriony mogą nie tolerować więcej niż 20 nanogramów całkowitej ilości morphino na jedną iniekcję. Wykonać iniekcje embrionów w ten sam sposób, co poprzednio.

Utrzymaj stałe objętości iniekcji pomiędzy grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi, które powinny obejmować zestawy wstrzyknięte z każdym morpho osobno pod mikroskopem stereoskopowym. Monitoruj wstrzyknięte embriony bezpośrednio po iniekcji oraz kilkakrotnie w ciągu dnia, używając pipety transferowej do usuwania martwych lub obumierających embrionów. Ponieważ mogą one wpłynąć na żywotność pozostałych morphin, za pomocą pipety transferowej usuwaj uspokojone lub uśmiercone embriony w dowolnym momencie.

Przenieś próbkę na szkiełko z zagłębieniem w celu obserwacji. Do wykonania fotografii. W razie potrzeby użyj ostrych pęsety, aby usunąć chorion.

Zestabilizuj embrion w kropli 3% metylocelulozy; przesiewaj embriony w poszukiwaniu wyraźnego fenotypu, charakterystycznego dla kombinacji morphino, w przeciwieństwie do zwiększonej penetracji fenotypu pojedynczych morphino. Przedstawiono tutaj kilka embrionów typu dzikiego po wstrzyknięciu morphino w dawce progowej. W przypadku gata five typowym fenotypem jest cardio bifida lub dwa serca, co wynika z braku połączenia się progenitorów w linii środkowej.

Zwróć uwagę na kardiomiocyty wykazujące pozytywną ekspresję GFP, wskazane strzałkami. Fenotyp dla sześciu morfin obejmuje zdeformowane serca, które nie zakręcają prawidłowo. Embriony te również wykształcają kardiomiocyty wykazujące pozytywną ekspresję GFP.

Jednakże zarodki wstrzyknięte z kombinacją morfino gata five i gata six, pokazane tutaj, wykazują całkowity brak rozwoju kardiomiocytów, co wskazuje na to, że dla rozwoju kardiomiocytów musi być wykazana ekspresja gata five lub gata six. Te dwa geny są funkcjonalnie redundantne dla specyfikacji kardiomiocytów.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby najpierw w pełni zwalidować morphos i upewnić się w maksymalnym możliwym stopniu, że reprezentują one rzeczywisty knockdown pojedynczego genu docelowego po zastosowaniu tej procedury. W celu wykazania funkcji tych samych genów można zastosować inne metody, takie jak łączenie kondycjonalnych alleli null u myszy. Podobnie postępuje się w przypadku ssaków.

Po obejrzeniu filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat tego, jak określić, czy dwa geny są funkcjonalnie redundantne podczas embriogenezy.