Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest opracowanie taniej metody mikrocinematografii time-lapse o wystarczającej precyzji, aby generować powtarzalne i mierzalne wyniki. Osiągnięto to poprzez zastosowanie niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych do konstrukcji płytek z pożywką agarową lub szkiełek przedmiotowych. Uzyskane wyniki wykazują, że kompleksy płytek tych pozostają nawilżone i dostatecznie natlenione przez ponad tydzień w różnych typach pożywek i przy różnych stężeniach agaru.

Dodatkowo, ponieważ mikrocinematografia z odstępami czasu jest procesem powolnym, zastosowanie ośmiu niedrogich mikroskopów pomaga przyspieszyć akwizycję danych. Witam, nazywam się Ryan Taylor i reprezentuję laboratorium dr. Roya Welcha z Katedry Biologii na Uniwersytecie Syracuse. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia filmów poklatkowych z biofilmów bakteryjnych; w naszym laboratorium wykorzystamy tę procedurę do badania wielokomórkowego zachowania biofilmów MTIs.

Zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, zmierz gęstość komórek w kulturze Occus sanus namnożonej przez noc za pomocąt mierzaka CLUT. Przenieś 1 mL kultury do probówki wirówkowej o pojemności 2,5 mL, a następnie odwirowuj, przemyj i resuspenduj bakterie w medium TPM, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Użyj pipety i wierzchołka do całkowitego resuspendowania osadu, co może zająć pewien czas. Następnie dodaj 0,5 g aros do 50 mL TPM, które służy jako medium do analizy.

Należy również dodać 0,5 grama agaru do 50 mililitrów pożywki C-T-T-Y-E, która jest pożywką do dysków odżywczych, a następnie wysterylizować ją w autoklawie. Następnie utrzymać pożywkę w temperaturze 55 °C w inkubatorze lub kąpieli wodnej podczas przygotowywania testu śledzenia.

Kompleksy płytek są przygotowywane poprzez najpierw sterylizację szkiełka przedmiotowego w płomieniu palnika. Należy położyć na szkiełku sterylną uszczelkę z gumy silikonowej o grubości 0,5 mm. Za pomocą pipety nanieś około 300 µl pożywki C TT YE do zagłębienia utworzonego przez uszczelkę na szkiełku.

Po sterylizacji płomieniem kolejnego szkiełka przedmiotowego, należy położyć je pod kątem na pożywce C-T-T-Y-E. Umieszczenie szkiełka pod kątem zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza. Gdy szkiełko znajdzie się na miejscu, należy połączyć oba elementy za pomocą małych żabek biurowych, umieszczając jedną po każdej stronie.

Umieść przycięty kompleks w temperaturze czterech stopni Celsjusza i poczekaj, aż podłoże C-T-T-Y-E agro zastygnie. Zazwyczaj zajmuje to około pięciu minut. Po zastygnięciu agro można przygotować kompleksy płytek wykorzystywane w teście śledzenia.

Rozpocznij od przygotowania szkiełek do budowy kompleksów testowych. Dla każdego kompleksu wysterylizuj płomieniem dwa szklane szkiełka przedmiotowe. Na jedno z szkiełek połóż uszczelkę autoklawu, aby stworzyć podstawę testu.

Drugie szkiełko służy do spłaszczania agrosów oraz jako szkiełko podpierające. Górną część układu testowej stanowi szkiełko nakrywka. Najpierw owiń szkiełko przedmiotowe taśmą do etykietowania, następnie wysterylizuj szkiełko nakrywkę w płomieniu i umieść je na wierzchu wysterylizowanego, owiniętego szkiełka.

Przesuń w górę owinięte podpórki do szkiełek, które podtrzymują szkiełko nakrywkę, chroniąc ją przed pęknięciem. Za pomocą pęsety umieść uszczelkę do autoklawu na sterylizowanym płomieniem szkiełku nakrywce. Dociśnij uszczelki na dolnym szkiełku oraz na szkiełku nakrywce, aby upewnić się, że tworzą one szczelne połączenie ze szkłem.

W przeciwnym razie pożywki w matrycach mogą wyschnąć. Odstaw zestawy uszczelek do szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych stroną sterylną do góry; od tego momentu pracuj tylko nad jednym kompleksem na raz, aby zapobiec zestaleniu się pożywek, co mogłoby pogorszyć jakość filmu. Rozpocznij od umieszczenia dysku odżywczego.

Wyjmij kompleks dysków odżywczych z temperatury czterech stopni Celsjusza. Zdejmij osłonę i delikatnie oddziel preparaty, pobierając teraz zestalone agar C-T-T-Y-E za pomocą pipety mikrosamplującej z jednorazową szklaną końcówką 100 µL. Wycinaj dysk odżywczy o średnicy 1 mm z agaru C-T-T-Y-E i umieść go w wgłębieniu utworzonym przez uszczelkę na szkiełku nakrywce.

Następnie należy wyjąć podkładki z pożywką TPM z inkubatora i pipetować 300 µl do zagłębienia utworzonego przez uszczelkę na szkiełku nakrywce, w którym znajduje się dysk odżywczy. Pożywka TPM w podkładce powinna utworzyć wypukłość, aby wyrównać powierzchnię pożywki T-P-M-S-A. Jedno ze szkiełek sterylizowanych płomieniem i pozbawionych uszczelki należy położyć pod kątem na wierzchu podkładki z pożywką TPM. Ułożenie szkiełka pod kątem pomaga zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.

Zaciśnij kompleks za pomocą miniaturowych ż Conversely klipsów biurowych, umieszczając po jednym z każdej strony. Umieść zaciśnięty kompleks w temperaturze 4 °C i poczekaj, aż medium agarowe stężeje. Zazwyczaj zajmuje to około pięciu minut.

Po zastygnięciu podłoża agarowego wyjmij kompleks z temperatury 4°C. Zdejmij żabki biurowe i ściśnij koniec kompleksu. Aby poluzować owinięty taśmą szkiełko, wyjmij je i połóż na blacie do dalszego użytku.

Następnie, używając pęsety jako klina, oddziel zespół uszczelki szkiełka nakrywkowego i matrycy od szkiełka podporowego, a następnie zutylizuj szkiełko podporowe. Nie należy używać ruchu dźwigniowego przy oddzielaniu zespołu uszczelki i szkiełka nakrywkowego, ponieważ może to doprowadzić do stłuczenia szkiełka nakrywkowego i/lub przywarcia matrycy do szkiełka podporowego.

Po usunięciu lamellki wspierającej, umieść kompleks macierzy mediów z uszczelką lamellki na szkiełku owiniętym taśmą, stroną z uszczelką do góry. Umieść ten kompleks obok palnika, aby umożliwić odparowanie całej widocznej wilgoci z nowo odsłoniętej powierzchni media agros. Nie dopuszczaj do wysychania media agros przez czas dłuższy niż jedna minuta.

Ponieważ może to wpłynąć na zachowanie roju M Zant, należy przystąpić do wysiewania komórek na nowo przygotowany kompleks analityczny. Po odparowaniu nadmiaru wilgoci z podłoża kompleksu agros uszczelki szkiełka nakrywkowego, należy pobrać 0,5 µL skoncentrowanych komórek w celu ich naniesienia na podłoże. Przed zbliżeniem się do agros podłoża należy zwolnić nacisk końcówki pipety.

Na końcówce pipety pojawia się kropla zawiesiny komórek, co ułatwia ich naniesienie bez dotykania końcówką powierzchni agaru. Wgniecenie na powierzchni agaru może zmienić zachowanie roju mz. Przesuń pipetę pionowo w dół, aby wydać komórki w odległości około jednego milimetra od zatopionego dysku odżywczego.

Następnie pionowo wycofaj pipetę. W ten sposób zapewnia się, że rozkład komórek ma kształt koła. Po naniesieniu komórek umieść kompleks obok palnika, aby pozwolić plamce z komórkami wyschnąć przez nie więcej niż 20 sekund.

Po wysuszeniu dopasuj zespół uszczelki do szkiełka, tworzący dno kompleksu, do uszczelki na pokrywie. Wsuń nośnik uszczelki acro cell complex, tworzący górną część kompleksu. Delikatnie dociśnij elementy, aby utworzyć szczelne połączenie.

Przetrzyj powierzchnie szkiełka i nakrywki za pomocą chusteczki Kimwipe, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i zapobiec kondensacji. Bezpośrednio po oczyszczeniu szkiełek umieść preparat na podgrzewanym stoliku mikroskopu, kładąc szkiełko na dół, a nakryvkę do góry. Jeśli utworzyła się kondensacja, pozostaw preparat na podgrzewanym stoliku przez kilka sekund przed uruchomieniem oprogramowania do akwizycji obrazów.

Aby przygotować film, wybierz odpowiedni obiektyw mikroskopu: 2x, 4x lub 10x. Włącz kamerę oraz mikroskop i sprawdź poziom oświetlenia, aby upewnić się, że światło nie jest zbyt intensywne. Uruchom komputer i otwórz program do akwizycji obrazu.

Kliknij okno obrazu na żywo i ustaw ostrość mikroskopu. Obraz powinien być podobny do przedstawionego tutaj. Rozpocznij akwizycję obrazów.

Należy regularnie sprawdzać ostrość w ciągu pierwszej godziny, ponieważ agar w pożywce ma tendencję do osiadania, co powoduje przesunięcie płaszczyzny ogniskowania. Po zakończeniu akwizycji obrazów należy przenieść pozyskane pliki do pamięci magazynowej. Rozmontuj zespół szkiełek, mocząc go przez noc w 90% etanolu lub wyczyść uszczelki za pomocą TOLA w celu ich ponownego użycia.

Ten film poklatkowy przedstawia em poddane opisanemu tutaj testowi śledzenia. Szybkość rejestracji wynosi jeden obraz na minutę przy powiększeniu 20 x, a szybkość odtwarzania to 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy przedstawia populację eant the cells, w której 1% komórek wykazuje ekspresję GFP.

Film został stworzony poprzez scalenie naprzemiennych obrazów z kontrastu fazowego i obrazów fluorescencyjnych. Analizę przeprowadzono na C-T-T-Y-E w 1%Aros; szybkość akwizycji wynosi jeden obraz na minutę przy powiększeniu 100 x. Ten film poklatkowy przedstawia ruch ślizgowy M Anthes.

Ten test przeprowadzono na C-T-T-Y-E w 1%Aros; szybkość rejestracji obrazów wynosi jedna klatka na minutę przy powiększeniu 100 x. Ten film TimeLapse przedstawia ruchy drgające (twitching motility) P OSA. Ten test przeprowadzono na LB w 1%Aros; szybkość rejestracji obrazów wynosi jedna klatka na minutę.

Przy powiększeniu 20x szybkość odtwarzania wynosi 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy przedstawia motylność rojącą w odpowiedzi na Smar. Analizę przeprowadzono na podłożu LB i 1% Aris, a częstotliwość rejestracji obrazów wynosi jeden obraz na minutę.

Przy powiększeniu 20x prędkość odtwarzania wynosi 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy przedstawia ruch poślizgowy EGT. Analizę tę przeprowadzono na LB w 0,5%Tag szybkość przechwytywania wynosi jeden obraz na minutę, a przy powiększeniu 20x prędkość odtwarzania wynosi 120 obrazów na sekundę ze względu na kruchość 0,5%arose w lv.

W tym teście wykorzystuje się większe uszczelki pokazane na rysunku 1B. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób generowania filmów time-lapse z biofilmów bakteryjnych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie spieszyć się i być jak najdokładniejszym, aby uzyskać spójne wyniki.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.