Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ilościowy pomiar migracji komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii time-lapse. Osiąga się to poprzez najpierw pokrycie płytki hodowlanej z sześcioma studzienkami kolagenem, a następnie rzadkie wysianie badanych komórek na tak przygotowaną płytkę. W drugim kroku, za pomocą końcówki pipety, w płytce tworzy się ranę, zapewniając w ten sposób odpowiednią przestrzeń do migracji.

Następnie przygotowuje się mikroskop i wykonuje zdjęcia w regularnych odstępach czasu, wykorzystując system kontroli temperatury w celu ciągłego monitorowania w czasie rzeczywistym migrujących komórek. Ostatecznie protokół śledzenia cząstek służy do oceny różnic w średniej prędkości oraz całkowitym przemieszczeniu komórek badanych i kontrolnych. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test migracji w komorze unikowej, jest fakt, że nie opiera się ona na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym.

Zamiast tego pozwala ona na ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii nowotworów, takie jak: w jaki sposób konkretne geny lub leki wpływają na migrację komórek nowotworowych? Na dwa dni przed procedurą należy dodać 1,5 milliliters kolagenu rozcieńczonego w opti media do każdej studzienki płytki hodowlanej z sześcioma studzienkami, a następnie inkubować płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius jeden dzień przed procedurą.

Resuspendowane komórki docelowe w 2 mL DMEM z dodatkiem FBS na każdą studnię przenieść do każdej studni płytki pokrytej kolagenem ENC, inkubując komórki przez noc w temperaturze 37°C. W dniu przeprowadzenia procedury, za pomocą końcówki pipety, stworzyć ranę w komórkach hodowanych przez noc, a następnie przemyć każdą studnię PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości powstałe w wyniku powstania rany.

Do wypłukanych dołków dodaj pożywkę DMEM z dodatkiem FBS, a następnie sprawdź pod mikroskopem, czy utworzono wyraźną przestrzeń rany. Po włączeniu kamery mikroskopowej i aparatury do obrazowania żywych komórek, umieść płytkę na stoliku mikroskopu. Przykryj płytkę nową komorą kontroli środowiskowej dla żywych komórek, ustawiając termostat na 37 °C oraz stężenie dwutlenku węgla na 5%. Teraz otwórz oprogramowanie slide book w pasku menu.

Wybierz sterowanie ostrością, klikając przycisk z literą F w okręgu. W polu obiektywu skorzystaj z rozwijanego menu, aby zdefiniować obiektyw. W polu zestawu filtrów wybierz ustawienia, które skierują drogę światła do elementu I. Wybierz odpowiedni filtr dla oświetlenia w jasnym polu, a następnie kliknij „open Bright”.

Należy otworzyć migawkę pola jasnego. Następnie wybrać filtr pola jasnego na rewolwerze i obejrzeć próbkę przez okular, aby odnaleźć odpowiednie pola i ustawić ostrość obrazu. Następnie przesunąć rewolwer filtrów, aby zmienić drogę światła na prowadzącą do kamery. Aby przechwycić obraz w oprogramowaniu slide book, kliknąć sterowanie ostrością (focus control), wybrać XY, aby zaznaczyć różne pozycje widoczne przez okular, a następnie kliknąć ustaw punkt (set point), aby zablokować każdą z lokalizacji.

W celu wykonania przechwytywania obrazu należy ręcznie precyzyjnie ustawić ostrość obrazu z kamery wyświetlanego na ekranie, a następnie użyć narzędzi w oknie sterowania ostrością, aby dostosować pozycję Z stolika. Dla uzyskania najlepszych rezultatów zaleca się ustawienie ostrości na płaskich wypustkach komórkowych w pobliżu punktu styku z płytką, co ułatwi ostrość. Należy użyć suwaka, aby dostosować czasy ekspozycji do zakresu odpowiedniego dla ustawiania ostrości.

Jeśli wybrano wiele pozycji XY, należy dostosować ostrość dla każdej z nich, wybierając sterowanie ostrością, następnie XY, a potem punkt odwiedzin (visit point). W programie Slide Book należy wybrać ikonę kamery z paska menu, wybrać typ obrazowania (capture type), a następnie funkcję poklatkową (time lapse), aby określić czas trwania eksperymentu.

Z menu rozwijanego wprowadź pożądaną opóźnienie między początkiem jednego punktu czasowego a początkiem następnego. W polach przedziałów trzecie pole zostanie obliczone automatycznie na podstawie ręcznie wpisanych wartości. W sekcji multiple XY capture wybierz multi-point list dla eksperymentów obejmujących więcej niż jedną pozycję XY.

Na koniec należy nazwać plik w celu jego zapisania, przejść do sekcji sterowania akwizycją (capture control), wybrać opcję zaawansowaną (advanced), a następnie spool. Następnie, po każdym punkcie czasowym, należy przechwycić obraz do pamięci i zapisać go w pliku spool. Rozpocznij od kliknięcia na obraz.

W pasku menu książki slajdów wybierz opcję import z menu rozwijanego, a następnie kliknij slide book spool. Wybierz żądane pliki książki slajdów wygenerowane z eksperymentu migracyjnego dla różnych pól i punktów czasowych. Otwórz pierwszy plik, następnie w pasku menu wybierz mask i wybierz particle tracking protocol z menu rozwijanego.

W menu śledzenia cząstek wybierz protokół ręcznego śledzenia cząstek. Pojawi się okno z punktami czasu rozpoczęcia i zakończenia. Aby przeanalizować migrację losową, wybierz maskę, a następnie protokół śledzenia cząstek. Ponownie, aby wyznaczyć współrzędne środka obiektu, wybierz środek obszaru.

Następnie kliknij „track and continue”. Teraz wybierz pożądane statystyki dla każdej ścieżki, takie jak przemieszczenie i średnia prędkość. Jak pokazano tutaj, kliknij „calculate”, aby wyświetlić statystyki.

W tym polu przedstawiono przykład analizy migracji losowej ilościowo określonej pod kątem prędkości. Na wykresie rozstępu w tym eksperymencie odnotowano wzrost średniej prędkości w komórkach M-D-A-M-B 2 31 z wyciszonym genem supresora nowotworowego. W porównaniu z kontrolnymi komórkami M-D-A-M-B 2 31, migracja losowa komórek z pierwszej figury została tutaj przeanalizowana pod kątem przemieszczenia komórek.

Ponownie, w grupie z całkowitym wyciszeniem genu supresora nowotworu odnotowano zwiększone przemieszczenie komórek w porównaniu z kontrolną linią M-D-A-M-B 2 31. Komórki w tym filmie z mikroskopii wideo typu time-lapse (kontrolne komórki MDA MB 2 31) osadzono na kolagenie przez noc. Następnie obrazy były rejestrowane w odstępach godzinnych przez łącznie 18 godzin podczas migracji losowej.

Zwróć uwagę, jak komórki z czasem oddalają się od swoich pierwotnych pozycji. W tym filmie zarejestrowano i przeanalizowano migrację testowych komórek M-D-A-M-B 2 31 po nocnym wysianiu na kolagenie. Zauważ, że komórki testowe wykazują większą zdolność do migracji w porównaniu z komórkami kontrolnymi z poprzedniego filmu.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza inwazji komórkowej i dynas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład: jakie role odgrywają komórki w przerzutowaniu nowotworowym po jego rozwoju? Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii komórki do badania migracji komórek z wykorzystaniem izolowanych linii komórkowych nowotworu.