Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

W niniejszej procedurze wykorzystano obrazowanie żywych komórek do wizualizacji transferu HIV znakowanego GFP przez synapsy wirologiczne pomiędzy ekspresyjnymi dla HIV komórkami T kotów rasy jerk CAT a niezainfekowanymi pierwotnymi limfocytami T. Test transferu z komórki do komórki rozpoczyna się od transfekcji komórek T kotów rasy jerk CAT za pomocą HIV gag IG FP, zakaźnego fluorescencyjnego klonu HIV 1; transfektowane komórki kotów rasy jerk CAT wykazują ekspresję HIV gag IG FP. Następnie miesza się je z niezainfekowanymi pierwotnymi limfocytami T znakowanymi C-M-T-M-R i wprowadza do komory obrazowania, w której można obserwować transfer HIV znakowanego GFP przez synapsę wirologiczną.

Otrzymane dane są analizowane przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu w celu ujawnienia szczegółów transferu HIV przez synapsy wirologiczne limfocytów T. Cześć, nazywam się Benjamin Dale i pochodzę z laboratorium Ben Chena w Katedrze Medycyny w Mount Sinai School of Medicine. Nazywam się Greg McNerney z laboratorium dr. Thomasa Husera w NSF Center for Biophotonics w uc Davis Medical Center.

A ja jestem Deanna Thompson, również z laboratorium dr. Thomasa Husera. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wizualizacji transferu HIV-1 między komórkami z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek. W tej procedurze komórki Jurkat są transfekowane zakaźnym klonem molekularnym HIV-1; procedura ta jest przeznaczona wyłącznie dla przeszkolonego personelu laboratoryjnego pracującego w certyfikowanych warunkach bezpieczeństwa biologicznego.

Protokół przedstawiony w niniejszym materiale może być realizowany w pomieszczeniach do hodowli tkankowych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2+ lub 3. Praca z zakaźnym HIV w placówkach obrazowych musi zostać zatwierdzona przez lokalny instytucjonalny urząd ds. bezpieczeństwa biologicznego. Komórki jerk cat, wykorzystywane jako komórki donora, należy utrzymywać w stężeniu od 2×10⁵ do 8×10⁵ komórek/ml.

W hodowli komórek jerk cat stężenie komórek w medium przekraczające 8 × 10⁵ komórek/ml prowadzi do spadku wydajności transfekcji. Aby rozpocząć procedurę, należy przeprowadzFaucetć transfekcję 5 × 10⁶ komórek jerk cat za pomocą plazmidu wirusowego HIV gag IGFP. Stosując metodę amax nucleofection opisaną w towarzyszącym protokole pisemnym, należy pozostawić komórki do regeneracji przez noc. Mononuklearne komórki krwi obwodowej są oczyszczane z warstwy leukocytarnej (buffy coat) pełnej krwi ludzkiej metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll.

Pierwotne limfocyty T CD4+ są oczyszczane z mononuklearnych komórek krwi obwodowej poprzez selekcję negatywną przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD4+. Limfocyty T CD4+ wyselekcjonowane negatywnie są zbierane z kolumny magnetycznej i hodowane w naszym PMI z 10% FPS, uzupełnionym o 10 units per milliliter rekombinowanej ludzkiej IL-2. Można również podzielić izolowane pierwotne limfocyty T CD4+ na alikwoty i zamrozić je przy użyciu pojemników do mrożenia kriogenicznego. Pojemniki do mrożenia umieszcza się w zamrażarce o temperaturze -70 °C na minimum od trzech do czterech godzin.

Następnie komórki przenosi się do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania. Po przeprowadzeniu transfekcji komórek Jurkat oraz izolacji docelowych pierwotnych limfocytów T CD4+, w dniu następującym po transfekcji należy przystąpić do oczyszczania i znakowania komórek. Komórki Jurkat wykazują obecnie ekspresję infekcyjnego fluorescencyjnego konstruktu HIV.

Podczas pracy z próbkami zakaźnymi nosimy fartuch laboratoryjny zapinany z przodu oraz dwie pary rękawiczek. Usuń resztki komórkowe z transfektowanych komórek poprzez wirowanie na poduszce z medium o wysokiej gęstości Ficoll. Najpierw odmierz 1,5 ml Ficollu na dno probówki stożkowej o pojemności 15 ml.

Następnie delikatnie nakładamy na materiał gradientowy transfekowane komórki jerk hat w objętości 5 mL naszego medium PMI. Na tym etapie transfekowane komórki jerk hat są zdolne do produkcji zakaźnego HIV. W związku z tym wszystkie końcówki pipet, które miały kontakt z komórkami wykazującymi ekspresję HIV, muszą zostać zdezynfekowane 10% roztworem wybielacza.

Przed wyrzuceniem do pojemnika znajdującego się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zakręć probówkę, spryskaj jej zewnętrzną powierzchnię roztworem 70% etanolu i wytrzyj suchą chusteczką Kimwipe; odwiruj komórki przy 400 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem. Po wirowaniu, za pomocą pipety ostrożnie pobierz komórki z granicy fazy medium i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Rozcieńcz komórki w naszym medium PMI do całkowitej objętości 15 ml i odwiruj przy 300 G przez 10 minut.

W temperaturze pokojowej zawieszamy osad w trzech mililitrach pożywki hodowlanej z dodatkiem surowicy cielęcej płodowej i przenosimy do dołka o średnicy dwóch centymetrów w płytce sześciodołkowej. Płytkę umieszczamy w inkubatorze do hodowli tkanek do czasu wykorzystania następnego dnia. Wieczorem tego samego dnia znakujemy pierwotne limfocyty T CD4+ wykorzystywane jako komórki docelowe, aby odróżnić je od komórek donora. Najpierw otrzymujemy osad z 4 × 10⁶ pierwotnych limfocytów T CD4+ poprzez wirowanie przy 400 ×g przez 10 minut.

Następnie przemyć komórki pięcioma mililitrami PBS i resuspender w dwóch mililitrach PBS, dodać CellTracker Orange do stężenia końcowego 1,5 µM i inkubować w temperaturze 37 °C przez kilka minut. Po zakończeniu inkubacji dodać osiem mililitrów kompletnego medium chicka i odwirować przy 400 ×g przez 10 minut.

Resuspender komórki w trzech mililitrach pełnej pożywki uzupełnionej o 10 jednostek na mililitr IL2 i pozostawić w inkubatorze do hodowli tkanek na noc. Po inkubacji nocnej komórki dawcy i docelowe są gotowe do eksperymentu transferu komórka-komórka. Przed rozpoczęciem eksperymentu transferu komórka-komórka należy przygotować komorę obrazującą, aby zabezpieczyć platformę przed wahaniami temperatury w pomieszczeniu.

Aby zablokować światło tła w pomieszczeniu, cały zestaw grzejny mikroskopu zostaje przykryty dużym czarnym pokrowcem, co tworzy wokół systemu izolującą poduszkę powietrzną. W komorze obrazowania utrzymywana jest stabilna temperatura 37 °C przy użyciu grzejnika termostatycznego z termoparą typu T umieszczoną obok próbki w celu sprzężenia zwrotnego temperatury. Przed zamocowaniem próbki należy przeprowadzić wstępne podgrzewanie przez 30 minut.

Obrazowanie konfokalne z wirującym dyskiem przy użyciu odwróconego mikroskopu optycznego jest wykorzystywane do tworzenia trójwymiarowych obrazów konfokalnych transferu HIV z komórki do komórki. Cała aparatura i proces akwizycji, w tym sterowanie stołem Z, są kontrolowane przez oprogramowanie IQ wersja 1.8. Skanowanie jest wykonywane przez jednostkę konfokalną z wirującym dyskiem CS U 10, która jednocześnie wykorzystuje ponad 800 punktów konfokalnych, aby znacznie zwiększyć szybkość skanowania i uzupełnić jego prędkość. CS U 10 jest sparowany z wysoce czułą kamerą CCD z mnożeniem elektronów (electron multiplying charged coupled device), co umożliwia szybkie obrazowanie przy słabym oświetleniu, co redukuje zarówno fotobleakowanie, jak i fototoksyczność.

Źródłem światła fluorescencyjnego jest wielodługościowy laser jonowy argonowo-kryptonowy. Do wyboru pożądanych długości fal, które w tym przypadku wynoszą 488 nanometrów i 568 nanometrów, wykorzystuje się akustyczno-optyczny filtr strojący (AOTF), kontrolując jednocześnie ich moc w celu dalszej redukcji fotoblaknięcia i wydłużenia czasu obrazowania. AOTF szybko odcina wiązkę lasera po każdej ekspozycji trwającej od 15 do 30 milisekund, gdy kamera nie przejmuje obrazów, co zapobiega niepotrzebnej ekspozycji podczas przesyłania obrazów z kamery EMCCD do komputera.

Światło laserowe jest wprowadzane do systemu z wirującym dyskiem za pomocą czteropasmowego lustra dichroicznego 405/488/561/647. Emisja fluorescencyjna jest rozdzielana według długości fali za pomocą lustra dichroicznego długoprzepustowego 560 nm z rozdzielaczem obrazu. Kanał zielony jest filtrowany za pomocą filtra pasmowego 525/50 nm, a kanał czerwony za pomocą filtra pasmowego 609/54 nm. Oba kanały są rzutowane obok siebie na kamerę E-M-C-C-D.

Podczas nagrzewania się komory obrazującej, przygotuj komórki do eksperymentu z transferem międzykomórkowym. Użyj hemocytometru do policzenia komórek ette ekspresyjnych dla HIV gag IGFP. Umieść hemocytometr w szalce Petriego, aby uniknąć bezpośredniej ekspozycji na komórki ekspresyjne dla wirusa.

Przemyj komórki pożywką niezależną od dwutlenku węgla i resuspenderuj w pożywce do obrazowania żywych komórek w stężeniu od 1 do 3 × 10⁷ komórek na ml. Zastosowanie pożywki niezależnej od dwutlenku węgla eliminuje konieczność użycia komory inkubacyjnej z CO₂ do obrazowania.

Komórki należy policzyć, przemyć i resuspender znakowane pierwotne limfocyty T CD4+, w taki sam sposób jak w przypadku komórek Jurkat. Następnie należy zainicjować transfer międzykomórkowy: zmieszać 20 µL transfekowanych HIV gag IGFP komórek Jurkat z 40 µL znakowanych pierwotnych limfocytów T CD4+ i nanieść 50 µL mieszaniny do przepuszczalnej dla gazów mikrokomory EBD przeznaczonej do hodowli tkankowej. Zamknąć komorę za pomocą korków i zabezpieczyć je, owijając styki korka z komorą EBD parafimem.

Przetrzyj komorę obrazowania chusteczką nasączoną 70% ethanol i pozostaw do krótkiego wyschnięcia w dygestorium. Przenoś zamkniętą komorę obrazowania w szczelnym pojemniku, aby uniknąć przypadkowej ekspozycji. Jeśli komora nie zostanie upuszczona podczas transportu, niezwłocznie po załadowaniu komory obrazowania IBD komórkami, zamocuj urządzenie na mikroskopie.

Wykonaj obrazy par komórek, używając obiektywu imersyjnego z olejkiem 60 x 1,42 NA, ponieważ wysoka apertura numeryczna znacznie poprawia rozdzielczość, co pozwala zmaksymalizować szybkość akwizycji dla stosów obrazów 3D. Ogranicz obszar rejestracji kamery EM CD do bezpośredniej okolicy pary komórek. Ponadto, zastosowanie dużego kroku Z pomiędzy 0,45 a 0,75 micrometers może również pomóc w przyspieszeniu akwizycji w tych warunkach.

Obrazy są rejestrowane w sposób ciągły w odstępach od 20 do 60 minut. Powtarzalne obrazowanie tego samego miejsca próbki może trwać do sześciu godzin przy minimalnym fotobieleniu podczas akwizycji. Każdy segment danych składa się z dziesiątek tysięcy obrazów, które mogą zajmować łącznie od 5 do 20 gigabajtów.

Aby ułatwić transport i analizę dużych plików, każdy z nich został podzielony i wyeksportowany jako jednogigabajtowe segmenty plików obrazów TIFF. Do analizy uzyskanych obrazów należy użyć jednego z wielu programów do analizy obrazu. Szczegółowe informacje na temat analizy obrazów, w tym korekcji wybielania intensywności oraz automatycznego i ręcznego śledzenia punktów gag, znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym.

W ciągu 10 do 15 minut od wymieszania można zaobserwować obrazowanie komórek Jurkat wykazujących ekspresję HIV gag IGFP przylegających do pierwotnych limfocytów T CD4+. W przypadku tych koniugatów można ocenić ruchy punktów gag w komórkach zainfekowanych, a także w komórkach docelowych. Po utworzeniu synapsy, w czasie od 30 minut do trzech godzin, można zaobserwować przemieszczanie się punktów gag IG FP do komórek docelowych znakowanych barwnikiem Cell Tracker.

Właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować przenoszenie HIV z komórki do komórki pomiędzy limfocytami T. Podczas wykonywania tych procedur bardzo ważne jest pamiętanie o przestrzeganiu wszystkich środków ostrożności dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego dwa plus (BSL-2+) lub trzy (BSL-3) podczas pracy z próbkami, które miały kontakt z komórkami wykazującymi ekspresję HIV. Pamiętaj również o stosowaniu dobrze utrzymanych komórek JCA oraz wolnego od endotoksyn DNA, aby zoptymalizować transfekcję.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.