Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Dzięki połączeniu hybrydyzacji in situ i barwienia tetramerami w technice znanej jako ISTH, można określić względną liczbę oraz relacje przestrzenne między efektorowymi komórkami odpornościowymi swoistymi dla antygenu wirusowego a komórkami i tkankami zainfekowanymi wirusem. Procedura ISTH rozpoczyna się od zatopienia świeżej tkanki zainfekowanej SIV w agarozie. Tkankę tnie się na sekcje o grubości 200 µm przy użyciu wibrotomu, a następnie barwi na obecność antygenu wirusowego.

Specyficzne komórki CD8+ przy użyciu tetramerów MHC znakowanych FITC. Po zamrożeniu, barwione skrawki są dalej cięte na sekcje o grubości 8 µm za pomocą kriostatu, a następnie przeprowadza się hybrydyzację in situ w celu lokalizacji komórek zainfekowanych wirusem. Mikroskopia konfokalna jest wykorzystywana do obrazowania podwójnie barwionych sekcji i ostatecznej rekonstrukcji oryginalnych grubych skrawków, aby ujawnić relację między efektorowymi komórkami układu odpornościowego a komórkami docelowymi.

Zastosowanie tej procedury do badania wczesnej infekcji SIV okazało się dobrym prognostykiem w określaniu ciężkości rozwijającej się choroby. Cześć, jestem Chinen Lee z zespołu badawczego Ashley HA w Katedrze Mikrobiologii na Uniwersytecie Minnesoty. Jestem Pam Skinner, adiunkt w Katedrze Biomedycznych Nauk Weterynaryjnych na Uniwersytecie Minnesoty.

Dzisiaj przedstawimy procedurę hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem tetramerami in situ, w skrócie ISTH. Oprócz stosowania barwienia tetramerami in situ w połączeniu z hybrydyzacją in situ, co demonstrujemy dzisiaj, rutynowo wykorzystujemy również barwienie tetramerami in situ w połączeniu z immunohistochemią, aby określić lokalizację, liczebność i profil ekspresji białek swoistych dla antygenu limfocytów T CD8 in situ. W barwieniu tetramerami in situ na grubych skrawkach pomogą nam dr Heon Kim i Terry Matala, a w przygotowaniu cienkich skrawków i hybrydyzacji in situ pomoże nam So. Zacznijmy zatem.

Aby rozpocząć tę procedurę, schłodź kąpiel Vibram zawierającą sterylną PBSH do 2 °C. Ustaw kąt ostrza wibratora na 27 stopni. W miarę możliwości utrzymuj świeże tkanki schłodzone na lodzie i rozpocznij procedurę w ciągu 24 godzin od pobrania tkanek.

Aby zminimalizować degradację podczas chłodzenia, należy również ułatwić wycięcie świeżej tkanki, usunąć tkankę łączną, a następnie za pomocą skalpela pociąć próbkę na małe fragmenty, umieścić je w naczyniu typu whey boat i pokryć 4% niskotopnym agarosem w PBS, roztopionym w temperaturze około 40°C. Należy upewnić się, że tkanka styka się z dnem naczynia i docisnąć fragmenty tkanki, jeśli wypływają na powierzchnię, a następnie pozostawić do zestalenia na lodzie przez trzy do pięciu minut.

W tym przypadku wykorzystana została tkanka śledziony, lecz przy użyciu skalpela można równie dobrze użyć węzłów chłonnych, pochwy, szyjki macicy, macicy lub innych świeżych tkanek. Wytnij agros wokół tkanki i za pomocą pęsety ostrożnie przenieś tkankę zatopioną w agros do bloku tkankowego. Następnie pokryj blok tkankowy Vibram klejem Loctite.

Nie przesuwać fragmentu tkanki po umieszczeniu go na bloku tkankowym. Pozostawić do wyschnięcia na lodzie przez około 10 minut. Następnie zamocować blok tkankowy w wibrotomie i wykrawać sekcje o grubości 200 µm, stosując bardzo małą prędkość posuwu do przodu i stosunkowo wysoką amplitudę.

Używając pędzla, przenieś wycięte skrawki do specjalnej komory tkankowej umieszczonej w dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, uprzednio napełnionej jednym mililitrem schłodzonego PBSH. Umieść do czterech skrawków tkanki w każdej komorze tkankowej. Opisz próbki i zabezpiecz pokrywkę płytki gumką recepturką, aby przeprowadzić barwienie skrawków tkanki w celu wykrycia limfocytów T swoistych dla wirusa.

Tetramery sprzężone z ZI są najpierw rozcieńczane w buforze blokującym do stężenia 0,5 µg/mL. Roztwór jest pipetowany do płytki 24-dołkowej w ilości 1 mL na dołek. Świeżo wycięta tkanka jest przenoszona do komór tkankowych na płytce i pozostawiona do inkubacji na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.

Należy pozostawić pustą studzienkę między komorami tkankowymi zawierającymi różne próbki, aby zapobiec krzyżowemu zanieczyszczeniu roztworów w kolejnych krokach. Na tym etapie można dodać przeciwciała skierowane przeciwko białkom zewnątrzkomórkowym lub białkom powierzchniowym komórek. Do płukania, po inkubacji pierwotnej, należy przygotować 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą schłodzony PBSH.

Przemyj dwukrotnie, przenosząc komory z tkanką do wypełnionej wcześniej płytki na 20 minut każdego razu; przed przeniesieniem upewnij się, że większość cieczy została odlana z komór z tkanką. Ponadto, podczas przenoszenia komór z tkanką uważaj, aby zawartość jednej próbki nie ściekła do drugiej, i monitoruj skrawki w komorach, aby upewnić się, że nie przywarły do ścianek. Po utrwalaniu utrwal skrawki świeżym 4%paraldehydem w PBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Przemyto dwukrotnie zimnym PBSH przez pięć minut każdego razem, aby wzmocnić sygnał z tetramerów. Inkubować przekroje z króliczymi przeciwciałami anty-fitzy w stosunku 1:10 000 w buforze blokującym przez jeden do trzech dni. Na tym etapie można dodać przeciwciała przeciwko epitopom wewnątrzkomórkowym.

Należy upewnić się, że komórki zostały uprzednio permeabilizowane, a miejsca niespecyficzne zablokowane przed dodaniem przeciwciała. Może być również wymagane odzyskiwanie antygenu po drugiej długiej inkubacji mającej na celu wzmocnienie sygnału. Przećć przekroje w PBSH trzykrotnie, za każdym razem przez co najmniej 20 minut, a nawet do kilku godzin.

Przeprowadź końcową inkubację z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Na przykład można zastosować przeciwciała kozie anty-królicze SI three, aby związać przeciwciała królicze anty-fitzy, co spowoduje czerwoną fluorescencję komórek barwionych tetramerem. Jeśli do przeciwbarwienia białek zainteresowania, takich jak CD eight w celu wizualizacji komórek T cytotoksycznych, użyto przeciwciał mysich, można zastosować przeciwciała kozie anty-mysie Alexa 488, aby związały się z przeciwciałami mysimi i spowodowały zieloną fluorescencję komórek barwionych przeciwciałami; rozcieńczenia każdego przeciwciała należy określić empirycznie.

Inkubować od jednego do trzech dni, chroniąc skrawki przed światłem poprzez owinięcie płytek folią aluminiową podczas inkubacji oraz w dalszej kolejności, ponieważ światło powoduje wygaszanie fluorescencji. Na koniec ponownie utrwalić skrawki, aby unieruchomić tetramery i przeciwciała. Przemyć i zamontować na szkiełku mikroskopowym w żelatynie glicerolowej zawierającej 4 mg/mL NP-40 i galianu dla przechowywania w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania cienkich skrawków do hybrydyzacji in situ.

Przetworzone preparaty z barwieniem tetramerem in situ można teraz analizować za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby określić lokalizację, liczebność oraz wzorzec ekspresji białek swoistych dla antygenu limfocytów T CD8+ w obrazie. Przedstawione przekroje tkanki śledziony od zainfekowanego SIV macaki rezesus zostały zabarwione tetramerami gag w celu oznaczenia swoistych dla SIV limfocytów T CD8+, przeciwciałami CD20 oraz przeciwciałami CD3. Ponieważ przeciwbarwienie przeciwciałami zostanie utracone w kolejnym kroku, ważne jest przeprowadzenie analizy tetramerów in situ przed przejściem do dalszych etapów.

Procedurę cienkiego krojenia należy rozpocząć od podgrzania sekcji o grubości 200 µm w temperaturze 70 °C przez pięć minut na bloku grzejnym, aby oddzielić grube sekcje od szkiełka. Po oddzieleniu sekcji należy je zatopić w OCT na suchym lodzie, najpierw wypełniając dno plastikowej formy OCT. Następnie należy umieścić tkankę na wierzchu OCT i przykryć ją OCT.

Użyj kriotomu do wycięcia przekrojów o grubości ośmiu mikronów z sekcji zatopionych w OCT, a następnie przymocuj te przekroje o grubości ośmiu mikronów do zasilikonizowanych szkiełek. Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w szczelnym pudełku do późniejszej hybrydyzacji in situ. Standardowa hybrydyzacja in situ jest stosowana do wykrywania komórek zainfekowanych wirusem za pomocą specyficznych dla wirusa sond rybowych znakowanych S 35.

Procedura obejmuje również pokrywanie skrawków emulsją śladów jądrowych oraz montowanie preparatów. W medium paramount kompatybilnym z fluorescencją obrazy konfokalne są pozyskiwane przy użyciu mikroskopu konfokalnego BioRad MRC 1000, który jest wyposażony w urządzenie do odbicia niebieskiego światła epi tube. Barwienie tetramerem in situ jest wizualizowane przy użyciu EPI one 605 dla czerwonego fluorochromu tetrameru oraz EPI 2 522 DF 32 dla zielonego fluorochromu CD8 w przypadku hybrydyzacji in situ.

Do obrazowania ziaren srebra powstałych w wyniku sygnału hybrydyzacji in situ w wywołanych autoradiogramach należy użyć oświetlenia EPI two blue reflection. Aby rozpocząć akwizycję obrazów, należy pobierać obrazy z każdego przekroju od lewej do prawej i od góry do dołu, dbając o to, aby każdy obraz nakładał się na obrazy sąsiednie w około 20%. Aby uniknąć luk w zrekonstruowanym obrazie montażowym, należy nazwać każdy obraz zgodnie z jego wierszem i kolumną w pliku Excel.

Po zakończeniu zbierania danych z preparatów, należy użyć oprogramowania confocal assistant do rzutowania seryjnych obrazów Z dla każdego kanału w jeden obraz, stosując procedurę akcji z programu Photoshop 7 dostępną od autorów, a następnie automatycznie połączyć rzutowany obraz z trzech kanałów w jeden obraz RGB. Następnie należy zszyć połączone obrazy w warstwach, aby wygenerować obraz montażowy całego przekroju. Pojedyncze ziarna srebra oraz barwienie tetramerem należy przypisać do komórek na montażu za pomocą programu Metamorph lub Photoshop.

Przypisz współrzędne XY środków lub identyfikatory OID komórek dodatnich pod kątem RNA wirusa oraz komórek dodatnich pod kątem tetrameru. Eksportuj dane OID do plików Excel jako wartości numeryczne dla każdej komórki i wykorzystaj dane zebrane w plikach Excel do określenia stosunku efektorów immunologicznych (komórek E) do celów wirusowych (komórek T), bazując na całkowitej liczbie komórek dodatnich pod kątem tetrameru i dodatnich pod kątem RNA wirusa w przekroju, aby uchwycić relacje przestrzenne między tymi populacjami komórek. Skopiuj i wklej odpowiednie wykresy z plików Excel do dokumentu w programie Photoshop.

Zmniejsz krycie warstwy, aby wyrównać i przeskalować siatki tak, by pokrywały się kolorami, zaznacz je, a następnie skopiuj i wklej do nowej warstwy. Pozycje niebieskich komórek RNA-dodatnich pozwalają usunąć warstwę służącą do wyrównywania siatek, dzięki czemu na spłaszczonym obrazie zostaną ujawnione pozycje komórek tetramer-dodatnich oraz viral RNA-dodatnich. Stosując przedstawioną tutaj metodę ISTH, jesteśmy w stanie śledzić odpowiedź immunologiczną na zakażenie SIV po inokulacji dopochwowej w tym miejscu wniknięcia oraz w tkankach limfatycznych, do których rozprzestrzenia się infekcja.

W tych miejscach tkankowych w 10. dniu po infekcji występuje duża liczba zakażonych komórek, jednak nawet trzy dni później obserwuje się komórki dodatnie pod kątem barwienia CD8 na zielono, ale nie ma jeszcze czerwonych komórek dodatnich pod kątem tetrameru specyficznego dla SIV. Odpowiedź immunologiczna jest zatem zbyt późna, aby wyeliminować infekcję.

Jednakże w trzecim tygodniu po zakażeniu wyraźnie widoczny jest spadek liczby zakażonych komórek, zwłaszcza w miejscu wniknięcia patogenu. Wykorzystaliśmy metodę ISTH, aby wykazać, że stopień tej redukcji był skorelowany z bliskością przestrzenną oraz względną liczbą efektorowych komórek odpornościowych dodatnich pod względem tetrameru w stosunku do komórek docelowych dodatnich pod względem N-S-I-V-R-N-A; określamy to mianem stosunku E do T in vivo.

Relacje przestrzenne są łatwo wizualizowane za pomocą tej metody, gdzie komórki efektorowe są zaznaczone na czerwono, a cele wirusowe na niebiesko w tym zainfekowanym węźle chłonnym. Wiele komórek efektorowych i docelowych znajduje się w bliskim sąsiedztwie i istnieją obszary, w których wiele komórek efektorowych otacza pojedynczą komórkę pozytywną pod kątem S-I-V-R-N-A, podczas gdy w innych obszarach komórka pozytywna pod kątem S-I-V-R-N-A występuje pojedynczo. Stosunek E:T jest obliczany w prosty sposób, gdy pozycje komórek zostaną określone i zapisane w pliku Excel w formie liczby każdej z nich.

Najskuteczniejsza kontrola infekcji wirusowej koreluje z dużą nadwyżką czerwonych efektorów nad zielonymi celami w stosunku 43 do jednego. W tym przypadku, w szyjce macicy i pochwie, gdzie rozpoczęła się infekcja, stosunki ETT w węzłach chłonnych były niższe. Dodatnia korelacja między wysokimi stosunkami ETT a redukcją ładunku wirusowego od wartości szczytowej wskazuje, że silniejsza odpowiedź immunologiczna w miejscu wniknięcia przekłada się na lepszą kontrolę infekcji.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób jednoczesnego wykrywania wysoce specyficznych komórek CDAT oraz komórek zainfekowanych wirusem in situ. Technika ta pozwala na jednoczesną wizualizację antygenowo swoistych limfocytów T oraz komórek zainfekowanych wirusem w tkankach. Metodę tę można zastosować do oceny szczepionek opartych na limfocytach T CD8+ oraz innych interakcji między patogenem a gospodarzem, które nie są związane z wakcynacją, podczas przeprowadzania tej procedury.

Ważne jest, aby wszystkie odczynniki pozostały wolne od RNaz przed przeprowadzeniem hybrydyzacji in situ. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.