Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych
4 października 2010
Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.
Badanie odpowiedzi komórkowej w czasie rzeczywistym na stymulację mechaniczną przeprowadza się poprzez uprzednią hodowlę komórek wykazujących ekspresję białek fuzyjnych GFP na szalkach z dnem szklanym przez 24 godziny. Drugim krokiem jest pokrycie końcówki AFM biotynilowaną fibronektyną. Następnie funkcjonalizowana końcówka AFM jest doprowadzana do kontaktu z powierzchnią komórki, aby umożliwić utworzenie silnej adhezji ogniskowej wokół końcówki AFM, co pozwala na bezpośrednią manipulację cytoszkieletem aktynowym poprzez połączenie macierz-integryna-aktyna pomiędzy pokrytą fibronektyną końcówką a komórką.
Ostatnim krokiem jest mechaniczna stymulacja żywej komórki poprzez kontrolowany ruch w górę końcówki AFM, tak aby siła w pionie była przyłożona w punkcie kontaktu z komórką bez zrywania silnej adhezji ogniskowej. Ostatecznie wyniki pokazują, że komórki reagują na stymulację mechaniczną poprzez wzmocnienie przytwierdzenia do podłoża oraz indukowanie reorganizacji cytoszkieletu aktynowego, co zarejestrowano za pomocą fluorescencyjnego obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym. Dzień dobry, nazywam się Andrea Trake, jestem adiunktem w Katedrze Biologii Systemów i Medycyny Translacyjnej w Texas A&M Health Science Center.
Witajcie, jestem Sum Lim. Jestem pracownikiem podoktorskim w Katedrze Biologii Systemów i Medycyny Translacyjnej w Texas A&M Health Science Center. Dzisiaj przedstawimy procedurę badania adaptacyjnego przebudowywania komórkowego w odpowiedzi na stymulację mechaniczną.
W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania przebudowy cytoszkieletu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Przejdźmy zatem do części praktycznej. Do tych badań wykorzystywana jest odwrócona mikroskopia Olympus IX 81 z modułem fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonym z głowicą skanującą CSU 22 Yokogawa.
Mikroskop sił atomowych Bio Scope SZ jest zamontowany na odwróconym mikroskopie optycznym. Cały system został umieszczony na stole optycznym klasy badawczej i został wcześniej szczegółowo opisany. Ten zintegrowany mikroskop wykorzystuje dwie kamery Quant EM z urządzeniem sprzężonym ładunkowo z mnożeniem elektronów (E-M-C-C-D).
Jeden służy do obrazowania powierzchniowego, a drugi do obrazowania konfokalnego. Układ konfokalny, składający się ze skanera z dyskiem obrotowym, zewnętrznego koła filtrów oraz kamery E-M-C-C-D, jest zamontowany na aluminiowej płycie bazowej umieszczonej na podkładce silikonowej, niezbędnej do tłumienia drgań. Cały układ konfokalny jest połączony z mikroskopem za pomocą kołnierza z gwintowaną tuleją.
Dzięki temu zespół ten może zostać odłączony od mikroskopu podczas pomiarów za pomocą mikroskopii sił atomowych lub pomiarów FM, aby uniknąć wibracji pochodzących ze skanera z wirującym dyskiem. Jako źródło wzbudzenia dla trybów obrazowania turf i konfokalnego wykorzystuje się laser argonowo-kryptonowy. Laser może być sprzężony z jednym z dwóch światłowodów, które doprowadzają wiązkę do przystawki turf lub do konfokalnej głowicy skanującej.
Systemem sterują dwa komputery. Jeden wykorzystuje oprogramowanie slide book do sterowania obrazowaniem optycznym, a drugi oprogramowanie nano scope do sterowania AFM. Na 24 godziny przed eksperymentem ze stymulacją mechaniczną umieść żywe komórki wykazujące ekspresję konstruktów GFP skierowanych przeciwko konkretnym białkom w naczyniu hodowlanym z dna szklanego. W dniu eksperymentu zastąp pożywkę hodowlaną pożywką wolną od czerwieni fenolowej.
Ponieważ eksperyment a FM jest bardzo wrażliwy na zakłócenia, należy unikać rozmów oraz dotykania stołu optycznego lub mikroskopu podczas pomiarów w celu zminimalizowania szumów. W pomiarach a FM należy odsprzęgać konfokalny skaner z dyskiem obrotowym od mikroskopu. Eksperyment rozpoczyna się od zamontowania naczynia z hodowlą komórkową na stoliku a FM, używając kołnierza magnetycznego do przymocowania naczynia do magnetycznego stolika mikroskopu.
W kształcie litery V ramionko sondy A FM zostało zmodyfikowane poprzez przymocowanie dwumikronowej biotynilowanej kuleczki szklanej. Ramionko jest łatwo widoczne pod mikroskopem. Kuleczka jest przyklejona na samym końcu ramionka; w tym miejscu należy kroplowo nanosić roztwór powlekający.
Aby przygotować sondę FM do eksperymentu, należy najpierw zamocować końcówkę w uchwycie szklanym, a następnie umieścić uchwyt szklany na podstawie stołu w celu powleczenia końcówki. Przemyj końcówkę, ostrożnie nakrapiając 10 µL soli fosforanowej w docosanie lub DPBS na sam koniec końcówki, a następnie osusz ją za pomocą chusteczki Kimwipe. Powtórz tę procedurę pięciokrotnie po przemyciu DPBS o stężeniu 1 mg/mL.
Avid w roztworze. Dodawać kroplami na końcówkę. Po powleczeniu końcówki avidonem inkubować przez pięć minut.
Przemyj końcówkę jeszcze pięć razy za pomocą DPBS. Następnie przeprowadź sieciowanie biotynilowanej fibronektyny na avadonie, dodając roztwór o stężeniu 1 mg/mL. Naniesienie powinno odbywać się kroplowo na końcówkę, a następnie należy inkubować przez 5 minut.
Na koniec ponownie przemyj końcówkę pięć razy przy użyciu DPBS, pozostawiając ostatnią kroplę na końcówce. Po przygotowaniu końcówki zamocuj ją w skanerze AFM. Po zamontowaniu końcówki AFM umieść ochronną silikonową osłonę wokół uchwytu.
Następnie przygotuj mikroskop do podglądu wideo. Potem ustaw końcówkę FM w centrum pola widzenia. Ustaw dźwignię optyczną, kierując wiązkę lasera na sam koniec wspornika.
Następnie zmień obiektyw na odpowiedni obiektyw o dużym powiększeniu do obrazowania pojedynczych komórek. Następnie wprowadź w pole widzenia komórkę, która zostanie poddana stymulacji mechanicznej, i wybierz miejsce na powierzchni komórki, w którym powinna spocząć końcówka AFM. Na koniec opuszczaj końcówkę AFM, aż zetknie się ona z wybraną komórką.
Po zetknięciu końcówki z komórką należy odczekać około 20 minut. Pozwala to na utworzenie silnej adhezji ogniskowej w punkcie styku AFM na powierzchni komórki. Po upływie czasu oczekiwania można rozpocząć procedurę stymulacji mechanicznej w ramach przygotowań do eksperymentu.
Przełącz z kamery wideo na kamerę E-M-C-C-D, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjnych komórek. Następnie wykonaj obraz początkowy komórki w stanie spoczynku. Wykorzystaj mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do wizualizacji aktynowego cytoszkieletu w obrębie całego ciała komórki.
W przeciwnym razie należy użyć końcówki do wizualizacji adhezji ogniskowych w celu stymulacji komórki. Wykorzystaj dźwignię, aby zastosować kontrolowany ruch w górę w odstępach czasowych co trzy do pięciu minut. Podczas pozyskiwania danych A FM operator musi stale monitorować napięcie pozycji Z piso, aby określić właściwy moment dla bieguna pionowego.
Równolegle z akwizycją danych FM, po każdym pionowym pociągnięciu, zarejestruj obraz konfokalny lub obraz typu turf komórki, korzystając z oprogramowania slide book. Na koniec, po zakończeniu eksperymentu stymulacyjnego, wycofaj końcówkę AFM z komórki. Komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych przetransfekowana mRFP aktyny i vcul.
Obrazowanie GFP przeprowadzono przy użyciu FM na powierzchni apikalnej komórki. Tę samą komórkę obrazowano przy użyciu turf na powierzchni bazalnej komórki. Tutaj oba obrazy są nałożone na siebie.
Obraz tej samej komórki został również zarejestrowany przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym w obrębie całego ciała komórki i przedstawiono go jako projekcję maksymalną stosu 3D. Widoczne są dobre nakładanie się obrazów z A FM i konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym. Komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych, przetransfekowana aktyną MRFP, była stymulowana mechanicznie za pomocą A FM i obrazowana za pomocą konfokalnej mikroskopii z dyskiem wirującym.
Błędy wskazują na włókna aktynowe, które wykazują znaczną przebudowę po stymulacji FM. Niektóre włókna aktynowe polimeryzują, podczas gdy inne depolimeryzują w wyniku stymulacji mechanicznej, a pozostałe włókna aktynowe łączą się w pęczki. Ze względu na przebudowę aktyny, zaprezentowaliśmy sposób mechanicznej stymulacji żywej hodowli komórkowej przy użyciu EFM przy jednoczesnym rejestrowaniu reorganizacji CY za pomocą metod obrazowania optycznego.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że eksperyment FM jest niezwykle szumiący i czuły. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w badaniach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wykorzystania zintegrowanego mikroskopu sił atomowych z obrazowaniem optycznym do mechanicznej stymulacji żywych komórek w hodowli. Metodologia obejmuje instrukcję krok po kroku oraz prezentuje reprezentatywne dane dotyczące odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Stymulacja mechaniczna
- Obrazowanie żywych komórek
Wprowadzenie
- Zrozumienie odpowiedzi komórek na bodźce mechaniczne jest kluczowe w biologii komórki.
- Mikroskopia sił atomowych umożliwia precyzyjną manipulację komórkami.
- Obrazowanie żywych komórek dostarcza informacji w czasie rzeczywistym na temat procesów komórkowych.
- Adhezja ogniskowa odgrywa kluczową rolę w przytwierdzaniu się komórek i ich odpowiedzi.
Cel badania
- Przeszkolić w zakresie obsługi specjalistycznego mikroskopu do badań żywych komórek.
- Zademonstrować efekty stymulacji mechanicznej na żywe komórki.
- Przedstawić szczegółowy protokół, umożliwiający badaczom replikację badania.
Zastosowane metody
- Komórki wykazujące ekspresję białek fuzyjnych z GFP są hodowane na szalkach szklanych.
- Sonda AFM jest powlekana biotynylanowaną fibronektyną.
- Funkcjonalizowana sonda AFM jest wykorzystywana do tworzenia adhezji ogniskowych z powierzchnią komórki.
- Stymulacja mechaniczna jest realizowana poprzez kontrolowany ruch sondy AFM w górę.
Główne wyniki
- Komórki wzmocniły swoje przytwierdzenie do podłoża po stymulacji.
- Zaobserwowano reorganizację cytoszkieletu aktynowego w odpowiedzi na siły mechaniczne.
- Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym pozwoliło uchwycić dynamiczne odpowiedzi komórkowe.
- Protokół skutecznie wykazał efektywność zastosowanej techniki.
Wnioski
- Zintegrowany mikroskop pozwala na skuteczne badanie reakcji żywych komórek na bodźce mechaniczne.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia mechaniki i adhezji komórkowej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie różnych typów komórek oraz zróżnicowanych warunków.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie sposobu, w jaki żywe komórki wyczuwają siły mechaniczne i adaptują się do nich, ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w szlakach mechanotransdukcji. To zintegrowane podejście, łączące AFM z obrazowaniem optycznym, umożliwia w czasie rzeczywistym uzyskanie rozdzielczości podkomórkowej w badaniu dynamiki cytoszkieletu i adhezji, zapewniając pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkryć poprzez powiązanie bodźców mechanicznych z reorganizacją strukturalną. Metoda ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez bezpośrednią wizualizację indukowanego siłą remodelingu aktyny oraz wzmacniania adhezji ogniskowej, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) podczas przedklinicznego wyboru celu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne, wykazując, w jaki sposób stymulacja mechaniczna wywołuje reorganizację cytoszkieletu aktynowego i wzmacnianie adhezji ogniskowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację zależnej od siły dynamiki cytoszkieletu w żywych komórkach adherentnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie sygnałów mechanicznych z efektami strukturalnymi, co zmniejsza niejednoznaczność w ocenie zaangażowania celów mechanosensytywnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustanowienie powtarzalnych protokołów stymulacji mechanicznej i obrazowania w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Odnosi się do standaryzacji testów i wyników ilościowych poprzez kontrolowany ruch końcówki AFM oraz zsynchronizowane odczyty fluorescencyjne.
- Skalowalność: Podkreśla możliwość ponownego wykorzystania platformy w różnych typach komórek przylegających, co umożliwia rzetelną ocenę związków w kampaniach przesiewowych z zakresu mechanobiologii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omówienie związku z chorobą poprzez wykazanie strukturalnego sprzężenia od strony apikalnej do bazalnej, w którym stymulacja apikalna indukuje reorganizację w obrębie całego ciała komórki.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Opis ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez rejestrację dynamicznych odpowiedzi, które pozwalają na dopasowanie biomarkerów w szlakach mechanotransdukcji.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Koncentracja na wartości predykcyjnej redukcji ryzyka poprzez wykazanie, w jaki sposób przyłożenie siły prowadzi do polimeryzacji, depolimeryzacji i wiązkowania aktyny, co wyjaśnia mechanizm działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących, zapewniając wgląd w mechanizmy działania przed etapem przesiewowym związków.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez poprzez zastosowanie kontrolowanej stymulacji mechanicznej i obserwację przebudowy cytoszkieletu w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez odtwarzalne tworzenie adhezji ogniskowych oraz ilościowe obrazowanie dynamiki aktyny z wykorzystaniem modalności TIRF i konfokalnej.
- Analityka: Podkreśla pomiary, takie jak zdarzenia polimeryzacji/depolimeryzacji aktyny i zmiany intensywności adhezji ogniskowych, które umożliwiają porównanie stanów stymulowanych i spoczynkowych.
- Badania translacyjne: Łączy tę metodę z ciągłością przedkliniczną, pokazując, jak apikalna stymulacja mechaniczna propaguje zmiany strukturalne przez ciało komórki, co jest istotne dla przenoszenia sił na poziomie tkanki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako możliwość ponownego wykorzystania w badaniu celów mechanosensytywnych w modelach komórek naczyniowych, nabłonkowych i mezenchymalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celów, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach mechanotransdukcji.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność stymulacji mechanicznej oraz obrazowania multimodalnego.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane biologiczne ryzyko na późnych etapach w programach z zakresu mechanobiologii.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o rozwoju oparte na bezpośredniej obserwacji indukowanej siłą adaptacji komórkowej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana wiedza naukowa w zakresie obsługi AFM, obrazowania żywych komórek oraz dynamiki cytoszkieletu.
- Wymagane instrumentarium obejmuje zintegrowany system AFM-TIRF-konfokalny z tłumieniem wibracji i podwójnymi kamerami EM-CCD.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga przestrzegania protokołów funkcjonalizacji końcówki, tworzenia adhezji ogniskowych oraz czasu stymulacji.
- Kwestie adaptacyjne obejmują różnorodną sztywność podłoża, białka powlekające i typy komórek przy zachowaniu specyficzności stymulacji apikalnej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czułość na szumy podczas pomiarów AFM oraz konieczność kontrolowania warunków środowiskowych w celu zminimalizowania dryfu.
