Pseudozłamanie: model ostrego urazu tkanek obwodowych

W przypadku złamania kości długiej, takiej jak kość udowa lub piszczelowa, uszkodzone mięśnie i tkanki miękkie zostają wystawione na kontakt z odłamkami kości oraz szpikiem kostnym. Następnie dochodzi do silnej odpowiedzi immunologicznej, która wspomaga regenerację tkanek. Model do badania skutków takiej ekspozycji można stworzyć poprzez pobranie obu kości udowych i piszczeli.

Od myszy dawcy. Kości są kruszone w celu przygotowania roztworu kostnego, który następnie jest wstrzykiwany do uszkodzonego uda myszy biorcy. Następnie monitoruje się odpowiedzi immunologiczne i ocenia uszkodzenia odległych narządów, aby zbadać długofalowe skutki urazu wywołanego złamaniem.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod urazów tkanek obwodowych, takich jak model obustronnego złamania kości udowej, jest to, że model ten, model pseudo-złamania, umożliwia długotrwałe przeżycie bez powikłań związanych z przedłużoną anestezją lub skomplikowanymi technikami stabilizacji złamań, a tym samym pozwala na badanie odpowiedzi immunologicznych w późnym okresie po urazie. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować następujące materiały: wiaderko z lodem, Betadynę, narzędzia chirurgiczne, kleszczyki hemostatyczne GRE, moździerz z tłuczkiem, pęsetę, igły 20 G, strzykawkę 1 cc, PBS, środki do anestezji oraz stożek nosowy do izofluranu. Pojedynczą, uśpioną osobę o odpowiadającym wieku i wadze.

Mysz dawca z modyfikacją genetyczną powinna dostarczyć wystarczającą ilość materiału dla trzech biorców. Przytwierdź dawcę taśmą do płyty z pleksiglasu, upewniając się, że kończyny dolne są przyklejone wyłącznie w obrębie końców stóp. Ostrożnie ogol kończyny dolne.

Następnie należy całkowicie pokryć je Betadine i alkoholem w celu zapewnienia sterylności, aby usunąć kości długie z kończyny dolnej. Wykonaj nacięcie chirurgiczne skóry w okolicy pachwinowej, a następnie kontynuuj nacinanie skóry wzdłuż kończyny aż do kostki; odsunie skórę i oddziel ją od powięzi podskórnej oraz mięśni, zarówno po stronie przyśrodkowej, jak i bocznej. Następnie wprowadź jedno ostrze nożyczek pod mięśnie położone przednio-bocznie w stosunku do piszczeli. Przesuwaj ostrze proksymalnie i dystalnie, aby czysto oddzielić mięśnie od leżącej pod nimi kości.

Powtórz tę technikę na tylnej i przyśrodkowej stronie spodniej części piszczeli, aby oddzielić mięśnie znajdujące się pod piszczelą. Podczas przesuwania się dystalnie, w celu oddzielenia strzałki od piszczeli w proksymalnej części tych mięśni kończyny dolnej, należy użyć minimalnej dodatkowej siły po stronie tylnej. Przetnij ścięgna jak najbliżej ich przyczepów i odsunął mięśnie dystalnie, pociągając całą grupą mięśniową w dół; lekkie szarpnięcie uwolni przyczepy dystalne od stawu skokowego. Przetnij staw skokowy za pomocą nożyczek.

Na tym etapie nie należy oddzielać kości piszczelowej od kości udowej; to połączenie zapewnia dodatkową dźwignię, która ułatwi oddzielenie kości udowej od stawu biodrowego. Zastosuj podobną technikę w celu uwolnienia mięśni z kości udowej. Wykonaj to od strony tylnej oraz, w razie potrzeby, zarówno od strony przyśrodkowej, jak i bocznej.

Przetnij dystalne przyczepy tych grup mięśniowych, aby uwolnić je ze stawu kolanowego. Rozszerz nacięcie skóry w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiednią ekspozycję, prowadząc je pod mięśniami. Aby wypreparować koniec kości udowej ze stawu biodrowego, wyjmij kość udową wraz z przytwierdzoną kością piszczelową z myszy dawcy i umieść je na sterylnej gazie.

Rozdziel obie kości w stawie kolanowym, chwytając każdą z nich osobno i delikatnie skręcając lub obracjąc obie kości w przeciwnych kierunkach wzdłuż ich osi podłużnych. Aby usunąć pozostałe przyczepy ścięgniste z kości długich, owiń długość kości kawałkiem gazy o wymiarach 4x4. Mocno chwyć i kilkukrotnie przetrzyj całą długość kości, aby usunąć pozostałe tkanki z ich powierzchni.

Umieść zebrane kości w sterylnej probówce mikrocentryfugowej o pojemności 1.5 ml na lodzie. Przenieś kości donora do dokładnie zdezynfekowanej komory z laminarnym przepływem powietrza. W celu przygotowania roztworu kostnego.

Okap należy przygotować, wyposażając go w sterylną podkładkę, sterylną moździerz i tłuczek, sterylną pęsetę, sterylną probówkę o pojemności 8 ml, sterylną PBSA, pipetę 1 ml z odpowiednimi końcówkami, pipetę 100 µl z odpowiednimi końcówkami, strzykawki 1 ml oraz igły 20G. Używając pęsety, przenieść kości do moździerza i za pomocą tłuczka delikatnie je rozkruszyć. Odmierzyć pipetą 1 ml PBS do moździerza i kontynuować rozcieranie pozostałych fragmentów, wykonując koliste ruchy, aby zapewnić pełną resuspensję.

Następnie dodaj kolejny 1 mL PBS i kontynuuj ucieranie w celu przygotowania roztworu kostnego, który powinien mieć różowy odcień. Powoli przelej roztwór z moździerza do probówki o pojemności 8 mL, upewniając się, że większe pozostałości pozostały w moździerzu. Przenieś roztwór kostny do strzykawki o pojemności 1 mL.

Przy użyciu igły 20 G roztwór kostny powinien być przechowywany w lodzie. Należy nanieść pipetą 1 µL roztworu kostnego na płytkę z agarowym podłożem Mac, rozprowadzając go równomiernie po powierzchni. Płytkę należy inkubować przez 24 do 48 godzin w celu zapewnienia sterylności.

Rozpocznij procedurę chirurgiczną w celu wstrzyknięcia roztworu w obszar uszkodzenia tkanek miękkich i kości, oceniając głębokość znieczulenia myszy znieczulonej pentobarbitalem poprzez ucisk palca u stopy. Umieść mysz w pozycji na plecach na płycie z pleksiglasu i unieruchom zwierzę, luźno owijając cienkimi paskami taśmy (stroną klejącą na zewnątrz) dystalne części każdej kończyny, używając trymera Oscar z ostrzem nr 40. Ogól brzuch, pachwiny oraz obszary ud zwierzęcia.

Przenieś mysz na sterylne pole operacyjne. Przetrzyj obszar operacyjny Betadyną. Następnie przemyj go alkoholem w celu sterylizacji.

Umieść na nosie myszy stożek zawierający kawałek gazy nasączony jednym mililitrem 99% isofluoranu. Gdy oddechy zwierzęcia zaczną zwalniać, zdejmij stożek. Jeśli w którymkolwiek momencie procedury będzie wymagana dodatkowa anestezja, można wstrzyknąć dodatkową dawkę pentobarbitalu lub podać isofluran.

Następnie złóż sterylną gazę i przykryj nią mysz w taki sposób, aby odsłonić jedynie głowę oraz kończyny dolne. Ten model uszkodzenia tkanek miękkich polega na obustronnym zmiażdżeniu kończyn tylnych. Upewnij się, że mysz jest ułożona z kończynami tylnymi lekko odwiedzionymi i rotowanymi na zewnątrz.

Ułatwia to dostęp do odpowiedniego mięśnia. Zgrupuj mięśnie zginacze kolana, aby wykonać uraz zmiażdżeniowy. Zaciśnij duży hemostatyk o długości 18 centimeter wokół mięśni tylnej części uda, w połowie długości kości udowej, tak aby wypukłość zakrzywienia była skierowana w stronę kości udowej. Zablokuj hemostatyk tylko jednym kliknięciem na 30 seconds.

Wprowadzić igłę przez skórę na głębokość dwóch do trzech milimetrów, tak aby stożek igły ledwo dotykał kości udowej. Wstrzyknąć 0,15 ml roztworu kostnego w zmiażdżoną muskulaturę uda po każdej stronie. Wyjąć igłę i szybko przycisnąć miejsce wstrzyknięcia palcem w sterylnej rękawiczce, aby zapobiec cofaniu się roztworu kostnego z rany.

Przytrzymaj ten palec w tej pozycji przez kilka sekund. Umieść mysz z powrotem w klatce i zapewnij jej pełną swobodę ruchów bezpośrednio po ustąpieniu działania znieczulenia. Odpowiednie leki przeciwbólowe muszą zostać podane w momencie budzenia się myszy.

Ten ogólny schemat przedstawia dwufazową odpowiedź odpornościową po urazie w punkcie czasowym zero. Indukowany jest uraz. Następuje po nim wczesna reakcja hiperzapalna, której szczyt przypada na szóstą godzinę, a której miarą jest ocena systemowego stanu zapalnego oraz dysfunkcji narządów oddalonych.

Drugim elementem pourazowej odpowiedzi immunologicznej jest opóźniona immunosupresja, mierzona dysfunkcją komórek odpornościowych, przedstawiona jako spadek około 48 godziny. Jest to reprezentatywny schemat odpowiedzi cytokin zapalnych w osoczu, która występuje wcześnie po urazie i stanowi przykład zapalenia systemowego. Stwierdzono również wzrost dysfunkcji organów oddalonych, mierzonej stopniem uszkodzenia wątroby, w podobnym przedziale czasowym.

Ten reprezentatywny schemat służy jako przykład ilustrujący dysfunkcję komórek odpornościowych w późnej fazie po urazie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu sterylności oraz precyzyjnej manipulacji przez cały czas trwania eksperymentu. Nie jest to model rzeczywistego złamania ani infekcji rany.