Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Nasze doświadczenie wzrokowe rozpoczyna się w momencie, gdy pigment wzrokowy w fotoreceptorach siatkówki pochłania fotony energii świetlnej, co ostatecznie prowadzi do zamknięcia kanałów sterowanych cyklicznymi nukleotydami w błonie komórkowej. Hamuje to uwalnianie neuroprzekaźnika glutaminianu zarówno z czopków, jak i pręcików. Uwolniony glutaminian jest wykrywany przez komórki siatkówki znajdujące się niżej w drodze sygnałowej, co pozwala na badanie sygnałów przekaźniczych.

Oczy są usuwane z uśpionej myszy. S są izolowane, zatapiane w bloku agaru i cięte przy użyciu wibracyjnego mikrotomu. Następnie skrawki siatkówki są umieszczane pod mikroskopem i stymulowane oświetleniem LED.

W międzyczasie wykonuje się rejestracje metodą patch clamp w celu pomiaru generowanych prądów lub potencjałów synaptycznych. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą zazwyczaj napotykają trudności ze względu na dodatkowe komplikacje związane z pracą w ciemności. Możliwość wizualizacji całego procesu pozwoli zatem uzyskać praktyczne wyczucie, które w inny sposób byłoby trudne do opisania.

Procedurę rozpoczyna się od pokrycia warstwą chlorku srebra elektrod rejestrujących i referencyjnych, które będą wykorzystywane w badaniu. Zanurz elektrody w roztworze 1 M NaCl. Następnie, używając źródła zasilania o napięciu 15 V z przebiegiem sinusoidalnym o częstotliwości 1 Hz, przyłóż do nich napięcie 15 V przez około 20 sekund.

Za pomocą mikropipetowania (pullera), przygotuj pipety do patch-clampu z polerowanego ogniem szkła krzemionkowego BO, dobierając oporność końcówki pipety w zależności od rozmiaru komórek docelowych. Dla ciał komórkowych o średnicy około 20 µm zastosuj pipety o oporności końcówki od 5 do 10 MΩ. W przypadku ciał komórkowych o średnicy około 5 µm zastosuj oporność końcówki od 12 do 15 MΩ.

Aby przygotować elektrody odniesienia do uziemienia, należy za pomocą strzykawki napełnić rurkę polietylenową 3,5% roztworem agaru przygotowanym w 1 mM chlorku sodu. Następnie należy przygotować następujące roztwory zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym: roztwór kąpieli zewnętrznej, roztwór do krojenia, wewnętrzny roztwór pipety z aspartanianem potasu oraz zatyczkę z agaru.

Wszystkie roztwory przechowywać w temperaturze 4°C do momentu ich użycia. W dniu przeprowadzenia eksperymentu odmierzyć około 1,5 ml wewnętrznego roztworu aspar긴ianu potasu. Następnie dodać rozcieńczony Fluor.

Wlej około 50 milliliters pożywki Aims zawierającej wodorowęglan sodu do światłoszczelnego pojemnika do przechowywania. Podłącz plastikową rurkę do butli z gazem zawierającym 5% carbon dioxide i 95% oxygen, aby zrównoważyć pożywkę Aims z gazem, a następnie umieść pojemnik w kąpieli wodnej o temperaturze od 30 do 32 degrees Celsius. Następnie napełnij butelkę 110 milliliters pożywki Aims zawierającej HEPES i umieść ją w lodzie.

Wyrównaj skład pożywki, przedmuchując roztwór 100%tlenem. Pozostałą pożywkę Aimesa zawierającą wodorowęglan sodu umieść w ogrzewanym zbiorniku na górze klatki Faradaya. Owiń parafilmem rurkę i górną część butelki, aby zatrzymać gaz w przestrzeni nad roztworem i wyrównać go z mieszaniną 5%dwutlenku węgla i 95%tlenu.

Używając szklanej rurki do napowietrzania, przygotuj 3% agar o niskiej temperaturze żelowania, dodając 0,75 g do 25 ml pożywki aims przy intensywnym ogrzewaniu. Roztwór należy podgrzać do około 115 °C podczas mieszania. Gdy roztwór stanie się klarowny i pozbawiony pęcherzyków powietrza, umieść stopiony roztwór agaru w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.

Przygotuj komorę pomiarową na mikroskopie odwróconym. Nasuń pięciocentymetrowy mostek agarowy na elektrodę odniesienia srebro/chlorek srebra i umieść go w komorze pomiarowej. Opór końcówki pipety można zmierzyć, napełniając pipetę roztworem wewnętrznym, umieszczając ją w uchwycie do pipet, a następnie wprowadzając uchwyt do głowicy wzmacniacza i zanurzając pipetę w roztworze. Aby zachować barwnik wzrokowy do pomiarów fizjologicznych, wszystkie procedury powinny być wykonywane w świetle podczerwonym przy użyciu gogli podczerwonych, jednak w niniejszym materiale wszystkie czynności zostaną przedstawione w świetle widzialnym.

Po uśmierceniu myszy należy za pomocą zakrzywionych nożyczek szybko usunąć gałki oczne. Gałki oczne należy umieścić na fragmencie papieru filtracyjnego, aby zapobiec ich toczeniu się. Następnie należy unieruchomić gałkę oczną pęsetą i za pomocą cienkiego ostrza dwustronnego wykonać nacięcie w rogówce.

Niezwłocznie po nakłuciu gałki ocznej należy przenieść oko do 60 mm szalki Petriego wypełnionej pożywką aims. Wykorzystując nacięcie w rogówce jako punkt wejścia, należy za pomocą małych nożyczek odciąć pozostałe fragmenty rogówki.

Następnie należy usunąć soczewkę oraz ciało szkliste, upewniając się, że siatkówka pozostała przytwierdzona do gałki ocznej. Umieść ją w nieprzepuszczającym światła pojemniku wypełnionym pożywką AIMS, równoważoną z 5% carbon dioxide w 95% oxygen w temperaturze 32 degrees celsius.

Następnie przekrój połowicznie jedną z czaszek gałki ocznej za pomocą ostrza skalpela nr 10. Oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego siatkówki.

Usuń krawędzie siatkówki, aby tkanka mogła leżeć płasko. Używając małej szklanej pipety Pasteura z lateksową gruszką, napełnij 35 milimetrową szalkę Petriego roztopionym agarem o niskiej temperaturze żelowania i przeciągnij pęsetą przez agar, aby sprawdzić jego konsystencję. Gdy agar zacznie tężeć, przenieś siatkówkę na jego powierzchnię.

Następnie, nie dotykając siatkówki, należy użyć zwiniętego kawałka chusteczki Kim wipe, aby wchłonąć nadmiar roztworu wokół niej. Nanieś dodatkowe dwie do trzech kropli agaru bezpośrednio na siatkówkę i szybko ustaw plastikowy cylinder, aby stworzyć wokół niej ściankę, utrzymując siatkówkę blisko centrum cylindra. Wpuść dodatkowy roztopiony agar, a następnie przenieś szalkę Petriego do kąpieli w lodowatej wodzie w celu schłodzenia. Po 30 sekundach wyjmij tkankę i użyj tłoka, aby wypchnąć blok agaru, naciskając od strony przeciwnej do siatkówki.

Używając jednostronnego ostrza żyletki, wyciąć mały blok agaru zawierający siatkówkę i przykleić go za pomocą kleju kropelkowego do ogranicznika z agaru na dysku z preparatem. Przenieść dysk z preparatem do uchwytu wibracyjnego mikrotomu i wlać do uchwytu lodowate roztwory AIMS, zapewniając całkowite zanurzenie bloku z siatkówką. Wycinać przekroje siatkówki o grubości około 200 micronów, stosując maksymalną częstotliwość wibracji ostrza i prędkość posuwu ustawioną tak, aby przecięcie siatkówki trwało od czterech do pięciu sekund.

Za pomocą ostrza skalpela nr 11 wycinaj z bloku po jednym użytkowym plastrze na raz. Umieść plastry zawierające siatkówkę w komorach rejestracyjnych i unieruchom je. Używając kotwic do plastrów, przeprowadź nylonowe nici przez kotwicę stabilizującą plaster.

Przytrzymaj agar otaczający siatkówkę, pozostawiając siatkówkę odsłoniętą. W celu przeprowadzenia pomiarów przenieś komorę rejestracyjną na stolik mikroskopu pionowego.

Zasłoń kurtynę i włącz źródło światła podczerwonego, aby obejrzeć skrawk na kamerze czułej na podczerwień. Pod mikroskopem zidentyfikuj skrawek siatkówki z nienaruszonymi fotoreceptorami pod odpowiednim kątem cięcia. Niektóre uszkodzenia powierzchni mogą być widoczne w wyniku procesu skrawania.

Używając pipety ze ściętą końcówką, delikatnie odessaj martwe ciała komórek. Aby usunąć tę cienką warstwę komórek, po odsłonięciu zdrowej warstwy żywych komórek, zidentyfikuj ciało komórki znajdujące się w interesującej nas warstwie. Przesuń końcówkę pipety tak, aby lekko wgniotła błonę komórkową, a następnie zastosuj delikatne podciśnienie (nacisk do wewnątrz), aby uzyskać szczelną połączenie o wysokiej rezystancji. Tryb whole-cell można osiągnąć poprzez przyłożenie podciśnienia do elektrody w celu przerwania ciągłości błony komórkowej.

Następnie stymuluj tkankę siatkówki światłem za pomocą diod LED, aby wywołać odpowiedzi. Po zakończeniu rejestracji wykonaj zdjęcie, używając odpowiedniego światła wzbudzenia dla fluoroforu, który przedostał się do komórki z wewnętrznego roztworu pipety. Przedstawiono tutaj potencjały wywołane światłem w ciemnoadaptowanym neuronie siatkówki w odpowiedzi na błyski światła o rosnącym natężeniu.

Rysunek ten przedstawia obraz fluorescencyjny wykonany z przekroju siatkówki, w którym komórki zostały wypełnione barwnikiem Lucifer yellow; wywołana fluorescencja ukazuje morfologię komórek, z których wykonano rejestracje patch-clamp. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo lepiej rozumieć niektóre z trudności związanych z wykonywaniem rejestracji patch-clamp z przekrojów siatkówki adaptowanej do ciemności. Celem tej procedury jest pomiar odpowiedzi wywołanych światłem w kontrolowanych warunkach oświetlenia.

Aby to osiągnąć, musimy najpierw wyizolować siatkówkę, zatopić ją w agarze, a następnie przygotować skrawki siatkówki, z których będziemy mogli wykonać rejestracje z pojedynczych komórek.