Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca²⁺ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie zatopionych w agarze przekrojów siatkówki do badania mikroukładów znajdujących się w zakończeniach presynaptycznych komórek dwubiegunowych. Osiąga się to poprzez pobranie siatkówki z oka złotej rybki zaadaptowanego do ciemności i wycięcie z niej niewielkiego prostokątnego fragmentu. Fragment siatkówki jest następnie zanurzany w przezroczystym roztworze agaru o niskiej temperaturze topnienia, który następnie utwardza się w odpowiednio schłodzonym roztworze do przygotowania przekrojów.

Kolejnym krokiem jest pocięcie stałego bloku agaru zawierającego prostokątny fragment siatkówki przy użyciu wibrotomu. Ostatnim etapem jest wizualizacja, identyfikacja i uszczelnienie (patch-clamp). Przymocuj zakończenie nerwowe komórki bipolarnej.

Ostatecznie wyniki przedstawiają presynaptyczny prąd wapniowy oraz synaptyczną egzocytozę fizyczną z pomiarami pojemności błony z atomizowanych i nienaruszonych zakończeń komórek dwubiegunowych. Cześć, nazywam się Han Kim. Jestem postdokiem w laboratorium PCO w Instytucie Burham.

Dzisiaj przedstawię metodę przygotowania plastrów siatkówki przedniej części oka w systemie AGA oraz zademonstruję pomiar pojemności metodą patch clamp w pojedynczym kanale. Aby rozpocząć tę procedurę, należy podzielić każde oko złotej rybki na pół, wykonując równomierne cięcie wokół przedniej części oka za pomocą nożyczek sprężynowych. Następnie oczka należy umieścić w schłodzonym roztworze do wycinania plastrów, pozbawionym wapnia.

W razie potrzeby usunąć soczewkę za pomocą pęsety. Następnie usunąć nabłonek barwnikowy przytwierdzony do siatkówki, oddzielając siatkówkę od kielicha oka za pomocą pęsety precyzyjnej z końcówką pod kątem 45 stopni. Po tym etapie przeciąć nerw wzrokowy, używając pęsety precyzyjnej lub nożyczek sprężynowych.

Następnie zastosuj ssanie za pomocą zmodyfikowanej pipety Pasteura lub dużej pipety transferowej. Aby usunąć siatkówkę, delikatnie usuń pozostałą część nabłonka pigmentowego przytwierdzonego do siatkówki. Powierzchnia oczyszczonej i zdrowej siatkówki powinna być gładka.

Następnie wyizolowaną siatkówkę inkubuje się w roztworze IDE o stężeniu około 0,03% przez 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że procedura usuwania ciała szklistego powinna być przeprowadzona przy słabym oświetleniu. W kolejnym kroku, za pomocą żyletki, wycina się prostokątny fragment siatkówki o wymiarach około dwóch na dwa milimetry, usuwając zakrzywione krawędzie tak, aby zachować pełną grubość siatkówki.

Następnie przenieś fragment siatkówki do małego pojemnika wypełnionego roztworem agaru, starając się zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki podczas jej umieszczania w płynnym agarze. Następnie zanurz siatkówkę z agarem bezpośrednio w lodowatym roztworze do skrawkowania, aby agar stężał. W kolejnym kroku wytnij z litego bloku agaru zawierającego prostokątny fragment siatkówki sześcian o wymiarach jeden na jeden na jeden centymetr.

Przyklej blok do powierzchni płytki tnącej w komorze do cięcia wstępnego. Następnie potnij blok na plastry o grubości od 200 do 250 mikronów w lodowatym roztworze do cięcia. Przy użyciu wibrotomu można uzyskać łącznie od pięciu do 10 plastrów, które pozostają żywotne przez około pięć do sześciu godzin.

Następnie przenieś jeden z przekrojów do komory rejestracyjnej. Umieść na wierzchu przekroju platynową ramkę w kształcie litery U z siatką nylonowych nici. Płucz przekrój w sposób ciągły z szybkością od 1 do 2 ml/min roztworem rejestracyjnym napowietrzanym karbogenem.

Na tym etapie należy użyć strzykawki z końcówką z filtrem 0,2 µm, aby napełnić szklaną pipetę do patch-clampu roztworem wewnętrznym do poziomu jednego lub dwóch centymetrów od tylnej części pipety. Następnie należy usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki. Pipetę należy przymocować w uchwycie.

Wywieraj dodatnie ciśnienie w pipecie i przesuń ją w stronę docelowego zakończenia za pomocą mikromanipulatora, przesuwając końcówkę w dół przez skibkę. Przesuwaj pipetę w kierunku bocznym, wykonując ruch zamiatania, aby upewnić się, że skibka nie jest przeciągana wraz z końcówką. Następnie przesuwaj końcówkę pipety wokół zakończenia, aby oczyścić powierzchnię błony.

Przesunąć końcówkę w dół, dociskając ją do krawędzi terminala, aby utworzyć wgłębienie, a następnie zwolnić ciśnienie dodatnie. Jeśli uszczelnienie gigaohmowe nie powstanie natychmiast, zastosować w pipecie lekkie ciśnienie ujemne. Po uzyskaniu uszczelnienia gigaohmowego przełączyć wzmacniacz patch-clamp EPC-9 w tryb zapisu onsell i zmienić potencjał podtrzymujący na -60 lub -70 mV.

Zastosuj szybką korekcję pojemności i poczekaj, aż rezystancja uszczelnienia ustabilizuje się w przedziale od 5 do 10 GΩ. Następnie przerwij błonę za pomocą krótkiego, delikatnego ssania, aby ustanowić konfigurację rejestracji z całej komórki.

Można również zastosować ssanie ustne zamiast strzykawki. Po ustanowieniu konfiguracji całokomórkowej na atomizowanym terminalu MB, należy zastosować 200 milisekundowy skok depolaryzacji od minus 70 do zera miliwoltów. Należy pamiętać, że przed i po tej depolaryzacji w trybie clampera napięciowego stosowana jest fala sinusoidalna o częstotliwości dwóch kilohertzów. W celu pomiaru pojemności błonowej depolaryzacja umożliwia bezpośredni pomiar wewnątrzkomórkowych prądów wapniowych aktywowanych przez otwarcie napięciowo zależnych kanałów wapniowych typu L przy użyciu wewnętrznego roztworu opartego na cezie.

Równolegle można monitorować skok pojemności spowodowany zależną od wapnia egzocytozą pęcherzyków synaptycznych, co zwiększa powierzchnię błony. Jeśli w nienaruszonej komórce bipolarnej MB zastosuje się metodę patch-clamp z pipetą na terminalu synaptycznym, nie zaobserwuje się wyraźnych prądów wapniowych ze względu na duże prądy upływu wynikające z sprzężenia poprzez połączenia szczelinowe w obrębie komórek bipolarnych MB. To, co się obserwuje, to duży prąd zewnętrzny o charakterze prądu upływu.

Można jednak nadal monitorować skok pojemności za pomocą wysokoczęstotliwościowego bodźca sinusoidalnego aktywowanego przed i po pokazanym kroku depolaryzacyjnym. Oto przykłady I-R-D-I-C, obrazy zakończeń komórek bipolarnych M. Nienaruszone zakończenia częściej mają kształt eliptyczny, jak pokazano w A i B, podczas gdy C przedstawia zakończenie zmodyfikowane, które ma kształt okrągły.

Metoda wypełniania barwnikiem może być również wykorzystana do klasyfikacji zakończeń komórkowych. Przedstawiono tutaj przykłady obrazów fluorescencyjnych zakończeń komórek bipolarnych MBI z nienaruszonym aksonem w D, częściowo przeciętym aksonem w e oraz całkowicie usuniętym aksonem w F. Ich teria są wskazane niebieskimi strzałkami. Przedstawiono tutaj bezpośrednie pomiary sygnałów obrazowania wapnia podczas egzocytozy i sprzężenia zwrotnego hamującego.

W terminalu komórki bipolarnej MB, przejściowy wzrost stężenia wapnia w telerii terminala MB został aktywowany przez skokową depolaryzację metodą voltage clamp; odpowiadający jej obraz fluorescencyjny telerii MB widoczny jest w B. Przykłady krótkotrwałej depresji synaptycznej uwalniania neuroprzekaźnika przedstawiono w C. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki podczas jej umieszczania w agarze zestawu. Poprawi to przyleganie preparatu do bloku agarowego.