In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Niniejszy eksperyment demonstruje elektroporację in ovo śródmózgowia zarodków kurzych w celu zbadania wpływu egzogennej ekspresji genów na rozwój śródmózgowia oraz różnicowanie neuronów dopaminergicznych. W pierwszej kolejności należy wstrzyknąć wybrany plazmid DNA do śródmózgowia zarodków kurzych w 11. stadium wg Hamiltona-Hamburgera, aby precyzyjnie wprowadzić egzogenne DNA do rozwijającego się pęcherzyka śródmózgowia. Następnie, przy użyciu specjalnie wykonanych małych elektrod, należy przeprowadzić elektroporację pęcherzyka śródmózgowia, aby dostarczyć egzogenne DNA bezpośrednio do progenitorów neuronalnych śródmózgowia.

Następnie należy zebrać zarodki w stadium 23 z wyraźną ekspresją M cherry w śródmózgowiu i wykonać optymalne przekroje poprzeczne śródmózgowia. Ostatecznie analiza barwienia immunocytochemicznego w kierunku markerów neuronów dopaminergicznych, takich jak tyrozynowa hydroksylaza, może wykazać różnicowanie progenitorów neuronalnych w dojrzałe neurony dopaminergiczne indukowane ekspresją genów zainteresowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami elektroporacji in ovo jest to, że protokół ten umożliwia specyficzną elektroporację błoniastą w celu badania różnicowania neuronów dopaminergicznych.

Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju śródmózgowia, można ją również zastosować do innych części układu nerwowego w celu przeprowadzenia analizy mapowania losów komórek oraz badania regulacji ekspresji genów. Aby uzyskać embriony w stadium 11 wg skali Hamburgera-Hamiltona, należy ułożyć każde zapłodnione jajo na boku i zaznaczyć górną stronę krótką kreską ołówka. Następnie tace należy umieścić na kołysce w wstępnie ogrzanym inkubatorze z nawilżaczem.

Co 24 godziny, począwszy od 41 godziny po zapłodnieniu, należy sprawdzać wilgotność i poziom wody. Następnie należy wyjąć jaja z inkubatora i przechowywać je w temperaturze pokojowej. Powierzchnię każdego jaja należy oczyścić 70% etanolem i wytrzeć do sucha.

Następnie przyklej dwa czterocentymetrowe kawałki taśmy klejącej obok siebie na jajku, tworząc duży prostokąt nad oznaczeniem ołówkowym. Wygładź taśmę na powierzchni jajka, aby wyznaczyć okno, używając strzykawki 10 ml z igłą o rozmiarze 18 G. Przebij skorupkę jajka, kierując igłę pod kątem w stronę przeciwną do żółtka, aby nie zakłócić stanu ani nie uszkodzić zarodka.

Pobrać pięć mililitrów albuminy z jaja. Oczyścić igłę 70% etanolem. Osuszyć igłę przed nakłuciem kolejnego jaja.

Wprowadź ustawienia dla wypalarki mikropipet. Następnie wyciągnij cienkościenne rurki kapilarne, tworząc igły do iniekcji za pomocą pipety P 10. Pobierz od 5 do 10 µL roztworu plazmidu do długiego końcówki kapilarnej pipety.

Następnie powoli napełnij szklaną igłę, tworząc ciągłą kolumnę cieczy bez pęcherzyków powietrza. Umieść napełnioną igłę w uchwycie przymocowanym do mikromanipulatora i mikroinjektora. Teraz, korzystając z mikroskopu sekcyjnego i ciemnego tła w celu lepszej wizualizacji igły, przytnij ją nożyczkami sprężynowymi w miejscu, w którym kończy się zielony płyn.

W miejscu poprzedniego otworu po igle wytnij okienko o średnicy od 2 do 2,5 cm w celu pobrania albuminy. Podczas wycinania obracaj jajko w jednej dłoni.

Należy pamiętać o oczyszczaniu nożyczek za pomocą chusteczki typu kim nasączonej 70% etanolem pomiędzy kolejnymi jajami. Następnie należy obejrzeć embrion kurczaka pod mikroskopem sekcyjnym. W razie potrzeby obrazowanie embrionu można usprawnić poprzez wstrzyknięcie pod niego 20% tuszu indyjskiego w PBS, przefiltrowanego przez membranę 0,22 µm. Embrion należy ustawić równolegle do toru wprowadzania igły, tak aby głowa była skierowana w stronę przeciwną do igły.

Powoli przebij rurkę neuralną pod kątem 45 stopni w miejscu połączenia śródmózgowia z rurką tylnomózgowia. Rozpocznij wstrzykiwanie za pomocą mikroinjektora pico spritzer z czasem trwania ustawionym na 25 milliseconds. Dostosuj czas w zależności od przycięcia igły; wypełnij jedynie pęcherzyk neuralny odpowiadający śródmózgowiu plazmidowym DNA zawierającym barwnik fast green.

Po wyjęciu igły do iniekcji, nanieś trzy krople roztworu penstrepcyny na zarodek. Zweryfikuj ustawienia elektroporatora B-T-X-E-M-C eight 30 w celu zapewnienia wydajnej elektroporacji. W pozycji brzusznej śródmózgowia umieść małe, wykonane na zamówienie platynowe elektrody w kształcie litery L na tym samym poziomie poziomym co dno rurki neuralnej, tak aby śródmózgowie zarodka znajdowało się w centrum pomiędzy dwiema elektrodami.

Naciśnij raz przełącznik nożny BTX i zwróć uwagę na pęcherzyki powietrza powstające wokół elektrod. Po każdej udanej elektroporacji ostrożnie wyjmij elektrody z jaja i wytrzyj je. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej nasączonej 70% ethanol nanieś kolejne trzy krople roztworu pen strep na embrion.

Następnie zakryj okienko kawałkiem przezroczystej taśmy pakowej o wymiarach 5 cm na 5 cm. Uszczelnij jajko, nie dotykając jego zawartości, a następnie umieść jajka z powrotem w inkubatorze z wyłączonymi obrotowymi taca. Po osiągnięciu pożądanego stadium, zbierz żywe zarodki do wspólnej szalki Petriego wypełnionej PBS dla każdego z warunków.

Następnie należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu do sekcji. Przesiewo przeanalizować zebrane embriony pod kątem ekspresji m cherry, a embriony pozytywne przenieść do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej. Każdy dołek należy wypełnić 1 mL świeżo przygotowanego 2% paraformaldehydu i inkubować przez trzy godziny w temperaturze 4 °C.

Utrwalone embriony przemyć 3 razy w PB S, a następnie umieścić w 15% sacharozie do czasu ich osiadania podczas równoważenia. Powtórzyć proces równoważenia w 30% sacharozie, a następnie każdy embrion zatopić w OCT, odpowiednio go orientując, aby uzyskać optymalne przekroje poprzeczne śródmózgowia do dalszych analiz.

Przygotuj przekroje mózgu średniego o grubości 18 µm za pomocą kriosztatu do dalszych analiz w ramach testu elektroporacji in ovo mózgu średniego embrionu kurczaka. Do embrionów kurczaka w stadium 11 wstrzykuje się koktajl plazmidowy zawierający fluorescencyjny marker mCherry, interesujące geny oraz barwnik Fast Green służący do monitorowania procesu iniekcji. Po elektroporacji mózgu średniego embriony są dalej inkubowane, a następnie embriony wykazujące ekspresję mCherry są pobierane, utrwalane i zatapiane w medium.

Następnie przygotowuje się krioprzekroje śródmózgowia. Próbki z pomyślnie wstrzykniętych i poddanych elektroporacji embrionów kurczaka analizuje się za pomocą barwienia immunocytochemicznego z użyciem markerów śródmózgowia, takich jak tyrozynowa hydroksylaza. Ekspresja m cherry jest zazwyczaj widoczna w regionie śródmózgowia po dalszym rozwoju, przy czym ekspresja m cherry służy jako marker wstrzyknięcia.

Zarodki wykazujące prawidłową ekspresję m cherry są następnie utrwalane, zatapiane i orientowane w celu przygotowania krioprzestrojów śródmózgowia. Tutaj specyfikacja losu dopaminergicznego w elektroporowanych progenitorach neuronalnych jest badana poprzez kolokalizację m cherry i genu z tagiem flag z markerem neuronów dopaminergicznych – hydroksylazą tyrozynową. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak regionalnie ograniczyć ekspresję genu do embrionalnych progenitorów neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, w tym jak wstrzykiwać konstrukty DNA specyficznie do obszaru śródmózgowia oraz jak precyzyjnie przeprowadzić elektroporację przy użyciu małych, wykonanych na zamówienie elektrod zgodnie z opisaną procedurą.

Inne metody, takie jak blokada (lockdown) zapśredniczona przez RNI lub ekspresja enhancerów powiązanych z genami reporterowymi, mogą zostać zastosowane do badania funkcji genów i regulacji genów w określonych regionach i typach komórek układu nerwowego.