Elektroeluowanie fragmentów DNA

Witajcie. Dzisiaj pokażemy Wam, jak przeprowadza się elektroelucję w celu oczyszczenia fragmentów DNA, takich jak produkty trawienia i PCR. Elektroelucja może być jedną z preferowanych metod w dalszych zastosowaniach, takich jak klonowanie i sekwencjonowanie. Wykorzystując ujemny ładunek elektryczny DNA, w polu elektrycznym umieszcza się wysoką barierę komórkową, co powoduje osadzanie się fragmentów i zapobiega ich dalszej migracji.

Ta metoda umożliwia oczyszczanie szerokiego zakresu rozmiarów fragmentów DNA z różnych źródeł z relatywnie wysoką wydajnością do 80%. Niskie koszty stanowią kolejną zaletę elektroeluowania w porównaniu do innych metod oczyszczania, takich jak kolumny czy zestawy z żywicami. Próbka DNA jest najpierw wizualizowana za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym barwionym bromkiem etydium, aby zidentyfikować i zwizualizować pożądany fragment do oczyszczenia, po czym należy przeprowadzić elektroforezę.

Jeśli fragmenty są wyraźnie odseparowane, można precyzyjnie określić te o zbyt małym rozmiarze. Po elektroforezie pożądany fragment jest starannie wycinany z żelu za pomocą nowej żyletki, dbając o to, aby wycinek żelu znajdował się jak najbliżej interesującego nas prążka.

Procedurę tę należy przeprowadzić przy zapewnieniu odpowiedniej ochrony przed światłem UV oraz w rękawiczkach. Po napełnieniu elektroelutora odpowiednim buforem do elucji i upewnieniu się, że pokrywa on powierzchnię środkowej platformy, plasterek żelu umieszcza się w jednej z komór jak najbliżej kanału V. W kanale V nie powinno znajdować się żadnych pęcherzyków powietrza.

Można tego uniknąć, przepłukując kanał buforem w celu usunięcia uwięzionego powietrza. Następnie do kanału V, od strony proksymalnej względem dołka, ostrożnie dodaje się 100 µL bariery wysokosolnej. Komorę zamyka się i podłącza elektrody do źródła zasilania, aby rozpocząć elektroelucję przy napięciu od 100 do 120 V.

Czas oczekiwania będzie zależał od wielkości fragmentu; dla dużych fragmentów do 20 kb wystarczająco będzie od 50 minut do godziny, natomiast małe fragmenty należy monitorować co 10 minut za pomocą światła UV, aby uniknąć dalszej elucji przez roztwór solny do końcowego buforu łańcuchowego. W tym przypadku poddano trawieniu 560 nanogramów plazmidu za pomocą enzymów ND1 i Entry w celu uwolnienia fragmentu o długości 900 par zasad, co odpowiada 84 nanogramom próbki.

W związku z tym, po umieszczeniu wycinka żelu w dołku, elektroelucja będzie trwać 25 minut przy napięciu 100 V. Po zakończeniu elektroelucji i zatrzymaniu fragmentów DNA w dolnej poduszce w kanale V, z kanału, od strony dystalnej odbiornika, odzyskuje się 400 µL roztworu i przenosi go do mikroprobówki 1,5 µL za pomocą cienkiej końcówki zamocowanej do mikropipety. Następnie przeprowadza się wytrącanie alkoholem poprzez dodanie dwóch objętości zimnego absolutnego etanolu i wymieszanie za pomocą wortexa. Dodatkowo, w celu zwiększenia wydajności odzyskiwania DNA, można dodać 2-3 µL glikogenu. Probówki inkubuje się w temperaturze -20 °C przez jedną godzinę lub alternatywnie przechowuje w tej temperaturze przez noc, a następnie wiruje w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością przez 25 minut.

Przezwirowano nadsącz i przemyto pellet, dodając 1 mL zimnego, 70% etanolu. Wirowano w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością przez 5 do 10 minut, po czym odlano nadsącz i pozostawiono do wyschnięcia w temperaturze pokojowej z probówkami w pozycji odwróconej. Następnie pellet resuspendowano w 10 do 15 µL wody wolnej od nukleaz i przystąpiono do oznaczenia stężenia próbki. W tym przypadku oczyszczoną próbkę resuspendowano w 10 µL wody i zmierzono w spektrofotometrze przy długości fali 260 nm, co wykazało stężenie 6,3 ng/µL, co odpowiada wydajności 75%. Można odnieść wrażenie, że korzystniej byłoby poświęcić zaledwie 10 minut cennego czasu na użycie gotowego zestawu.

Niemniej jednak, mimo czasu poświęconego na ten proces, będą Państwo w stanie kontrolować wiele zmiennych, co pozwoli na oczyszczenie szerszego zakresu próbek o zróżnicowanych rozmiarach i pochodzeniu. Jak można zauważyć w niniejszym przypadku, odnotowano wydajność na poziomie 75%, co jest wynikiem równym lub lepszym niż w przypadku większości zestawów do oczyszczania DNA. Dziękujemy za dołączenie do nas w dniu dzisiejszym.

Mamy nadzieję, że protokół ten okaże się pomocny w Państwa projektach badawczych.