Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest szybkie wykrycie obecności konkretnych bakterii, takich jak e coli, przy użyciu nowatorskich sond flu genicznych DNA Zyme. Najpierw, geniczne sondy DNA Zyme są generowane poprzez ligację. Następnie bakterie są hodowane w celu zwiększenia liczby cząsteczek docelowych, a z supernatantu przygotowywana jest odpowiednia mieszanina zewnątrzkomórkowa.

Surową mieszaninę zewnątrzkomórkową łączy się następnie z sondą DNAzymem; oddziaływanie pomiędzy sondą DNAzymem a cząsteczkami docelowymi prowadzi do rozcięcia sondy, która następnie fluorescencyjnie sygnalizuje obecność celu. Oddziaływanie pomiędzy sondą a celem jest wykrywane za pomocą fluorymetru jako wzrost względnej fluorescencji. Wyniki są następnie weryfikowane za pomocą analizy w denaturującej elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami opartymi na PCR lub przeciwciałach jest to, że procedura jest prostsza i łatwiejsza do przeprowadzenia. Choć metoda ta została opracowana z wykorzystaniem bakterii modelowej e coli, może ona zostać zastosowana do wykrywania innych bakterii chorobotwórczych przenoszonych przez żywność lub patogenów szpitalnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ mogą nie być przyzwyczajone do obchodzenia się z syntetycznymi sondami DNA i bakteriami. Procedurę w tym protokole prezentują Sergio Aguire, asystent badawczy z mojego laboratorium oraz Monso Ali, stażysta podoktorski.

R-F-D-E-C one to wyróżniony DNA Zyme. Składa się on z sekwencji katalitycznej EC one podkreślonej na czarno oraz sekwencji substratu FS one podkreślonej na zielono; w obrębie substratu znajduje się wiązanie RNA oznaczone niebieskim r, flankowane przez DT znakowane fluorescencyjnie oznaczone jako F oraz DT znakowane wygaszaczem oznaczone jako queue. RF SS one jest wersją przetasowaną RFD EEC one, w której sekwencja katalityczna EEC one jest częściowo przemieszana w SS one, natomiast część FS one pozostaje niezmieniona. RF DEC one oraz RF SS one są otrzymywane poprzez enzymatyczną ligację oligonukleotydu FS one z oligonukleotydem EC one lub SS one przy użyciu LT one jako matrycy ligacji, w celu przygotowania surowych mieszanin zewnątrzkomórkowych (cems), które będą służyć jako cel dla R-F-D-E-C one. Należy rozpocząć od odpipetowania 2 mL pożywki LB do sterylnych probówek hodowlanych o pojemności 14 mL przy użyciu pipety wielokanałowej.

Następnie, używając sterylnego końcówki do pipety, pobierz pojedynczą kolonię e coli z płytki agarowej i przenieś ją do probówki z pożywką LB. Umieść probówki w inkubatorze ustawionym na 37 °C i inkubuj przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM przez 14 godzin. Aby przygotować kulturę szczepionkową o stężeniu 1%, odmierz 2 ml świeżej pożywki LB do probówek o pojemności 14 ml i dodaj 20 µL kultury bakterii z poprzedniego etapu.

Inkubować probówki w temperaturze 37°C przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM, aż każda zawiesina bakteryjna osiągnie wartość OD 600 wynoszącą około 1. Przenieść 1 mL każdej hodowli do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i odwirować komórki przy 11 000 G przez pięć minut. Po wirowaniu przenieść klarowny nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.

Przechowywać nadsącz w temperaturze -20°C. Jeśli nie zostanie on niezwłocznie wykorzystany do określenia, czy w wyniku oddziaływania enzymów DNA z surowym ekstraktem komórkowym powstaje sygnał fluorescencyjny, próbki analizuje się metodą spektrofotometrii. Włączyć spektrofotometr fluorescencyjny i ustawić parametry akwizycji danych z wzbudzeniem przy 488 nm i emisją przy 520 nm.

Należy również ustawić instrument tak, aby dokonywał odczytów co minutę przez jedną godzinę. Trzy kuwety z kryształu kwarcowego należy przemyć najpierw wodą destylowaną i dejonizowaną, a następnie 100% etanolem. Kuwety należy osuszyć, przedmuchując je gazem azotowym.

Oznakuj kuwety: C1 dla kontroli 1, C2 dla kontroli 2 oraz T dla próby. Następnie przenieś 24 µL destylowanej wody dejonizowanej do kuwety C1 oraz 24 µL przygotowanej surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej E. coli do kuwet C2 i T. Do każdej kuwety dodaj 25 µL 2X RB i umieść je w spektrofotometrze fluorescencyjnym. Rozpocznij gromadzenie danych fluorescencji; po pięciu minutach dodaj 1 µL 5 µM RFS S1 do C2 oraz 1 µL 5 µM RFD eec1 do T i C1, dbając o to, aby pomiary fluorescencji nie zostały przerwane. Wymieszaj każdy roztwór poprzez pipetowanie, a następnie pozwól reakcji przebiegać do końca okresu akwizycji.

Zapisz dane w formacie pliku Excel. Następnie przenieś dane na komputer osobisty i użyj programu Excel do stworzenia wykresu. Użyto tych samych mieszanin reakcyjnych, które zostały wykorzystane do analizy za pomocą Spectra.

Fotometria może być wykorzystana do analizy za pomocą elektroforezy w żelu. Po godzinie akwizycji należy wyjąć kuwety ze spektrofotometru i przenieść roztwory do nowych probówek do mikrocentryfugi.

Zatrzymaj reakcje, dodając 5 µL 3 M octanu sodu oraz 125 µL 100% etanolu. Wymieszaj każdy roztwór za pomocą vortexa, a następnie umieść probówki w zamrażarce w temperaturze -20 °C na jedną godzinę. Po inkubacji odwiruj mieszaniny reakcyjne przy 11 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety.

Osady należy wysuszyć za pomocą koncentratora DNA przez 10 minut. Następnie dodać 20 µL buforu do ładowania żelu i krótko wymieszać w wirówce typu vortex. Próbki należy krótko odwirować w wirówce laboratoryjnej.

Następnie, po zakończeniu procesu, nanieś 10 µL próbek reakcyjnych do każdego dołka żelu 10% Dage. Zdejmij szklane płytki i dokładnie opłucz je wodą z kranu. Aby usunąć pozostałości żelu, przetrzyj płytki chusteczką Kimwipe.

Zeskanuj płytkę żelową pod kątem fluorescencji za pomocą skanera Typhoon. Przeanalizuj uzyskane obrazy przy użyciu oprogramowania do kwantyfikacji obrazów, aby ocenić czułość układu. Kultury poddane rozcieńczeniom seryjnym są inkubowane przez coraz dłuższe okresy czasu.

Aby określić minimalny czas inkubacji wymagany do wykrycia pojedynczej bakterii, należy przygotować 10 probówek z kulturą zawierających 2 mL lb, zaszczepić każdą kulturę 100 µL zapasu glicerolowego e coli o stężeniu 2 CFU/mL i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM przez 4, 8, 12, 16 i 24 godziny. Z każdej zaszczepionej probówki z kulturą należy pobrać 300 µL, biorąc pod uwagę, że w próbkach pobranych w punktach czasowych 4, 8 i 12 godzin mogą nie występować wykrywalne bakterie.

Pozostaw pozostałą hodowlę do wzrostu na 24 godziny w celu zidentyfikowania kultur zawierających bakterie. Zmierz OD 600 i osadź komórki poprzez wirowanie przy 11, 000 G przez pięć minut. Przenieś nadsącz zawierający CEMS do nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do dnia następnego.

Obejrzyj hodowle pod kątem wzrostu. Tylko jedna lub dwie z 10 hodowli mogą zawierać e coli po inokulacji, a pozostałe probówki nie będą zawierały żadnych komórek. Użyj CEMS odzyskanych z pozytywnych hodowli w wyznaczonych punktach czasowych do przygotowania reakcji rozszczepienia z RFD EEC one; analizuj mieszaniny reakcyjne za pomocą elektroforezy w żelu DAGE, zgodnie z wcześniejszym opisem. Zarówno sondy RFD EEC one, jak i RF SS one zostały przygotowane poprzez ligację enzymatyczną fragmentów DNAzymu do substratu.

Interakcję FS one z CEM EEC oraz RFD EEC one lub RF SS one oceniono następnie za pomocą spektrometrii. Jak widać tutaj, R-F-D-E-C one wygenerowało wysoki poziom sygnału fluorescencyjnego po dodaniu CEM ec.

W wyraźnym kontraście R FS S one nie wygenerowało silnego sygnału fluorescencyjnego. Zatem funkcja wytwarzania fluorescencji RFD EEC one. Po kontakcie z CEM EC następuje sekwencjonowanie.

Aby zweryfikować, czy zaobserwowany wzrost fluorescencji wynikał z rozszczepienia wiązania RNA, przeprowadzono analizę mieszanin reakcyjnych. Rozszczepienie RFD eec za pomocą 0,25 M wodorotlenku sodu powinno prowadzić do powstania fragmentów RNA: fragmentu 5', zachowującego fluorofor, oraz fragmentu 3', zachowującego wygaszacz. Jak widać tutaj.

Mieszanina reakcyjna RFD EEC CEM EEC rzeczywiście przyniosła oczekiwany produkt rozszczepienia. Co więcej, tylko UNC rozszczepiło R-F-D-E-C, a fragment 5' mógł zostać wykryty za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Aby zbadać swoistość RFD EEC, przeprowadzono testy fluorescencyjne z wykorzystaniem CEMS pobranych wyłącznie z kilku innych bakterii gram-ujemnych i gram-dodatnich.

Próbka zawierająca CEM EC wywołała wzrost fluorescencji. Brak reaktywności krzyżowej z CEMS pochodzącymi od innych bakterii wskazuje, że R-F-D-E-C one jest wysoce selektywne względem e coli. Aby określić minimalny czas hodowli wymagany do wykrycia pojedynczej komórki e coli, e coli rozcieńczono do poziomu 1 CFU na mililitr w 100 µL i hodowano w pożywce przez 4, 8, 12, 16 i 24 godziny. Otrzymane CEMS zmieszano z R-F-D-E-C one, a stopień cięcia oceniono za pomocą dage, jak pokazano tutaj.

Obraz z analizy Dage wskazuje, że próba R-F-D-E-C nie wytworzyła oczekiwanego produktu cięcia. Po reakcji z CEM, ECS zebrane w czwartej i ósmej godzinie wzrostu wskazują, że po opanowaniu metody wymagany będzie 12-godzinny czas hodowli.

Kluczowym elementem tej techniki jest to, że test oparty na enzymie DNAza może zostać przeprowadzony w 60 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Po tym opracowaniu procedura otworzyła badaczom w dziedzinie bioanalizy drogę do badania allogennych enzymów DNA w celu wykrywania szerokiego zakresu patogenów bakteryjnych.