Wyznaczanie kinematyki i siły reakcji podłoża: demonstracja ilościowej oceny zdolności lokomocyjnych szczurów młodych, dorosłych w średnim wieku oraz geriatrycznych

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę pomiaru sił reakcji podłoża oraz kinematyki kończyn tylnych u szczurów zachowujących się swobodnie. W pierwszej kolejności szczury są trenowane do regularnego pokonywania bieżni w celu otrzymania nagrody w postaci pożywienia. Następnie w kluczowych punktach anatomicznych kończyn tylnych umieszcza się markery odblaskowe.

Nagrania wideo oraz dane dotyczące siły reakcji podłoża są zbierane podczas przemieszczania się zwierzęcia w celu otrzymania nagrody pokarmowej. Markery odblaskowe są digitalizowane, a dane przetwarzane retrospektywnie. Jakościowe i ilościowe różnice w zdolnościach lokomocyjnych obserwuje się u szczurów w różnych modelach chorobowych.

Witam, nazywam się Aubrey Webb. Jestem adiunktem na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej oraz w Instytucie Mózgu Hotchkiss na Uniwersytecie w Calgary w Calgary, Alberta, w Kanadzie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak skale oceny lokomocji i inne miary punktowe, jest fakt, że dostarcza ona czułych, obiektywnych i ilościowych danych, które pomagają zróżnicować subtelne różnice pomiędzy grupami poruszających się szczurów.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki i ortopedii, takie jak określenie efektów potencjalnego leku terapeutycznego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię różnych modeli chorób, ponieważ ograniczone jest prawdopodobieństwo stwierdzenia braku efektu w sytuacji, gdy on występuje. Wykorzystując tę technikę, metoda ta pozwala uzyskać wgląd w lokomocję szczurów.

Metodę tę można zastosować również w innych układach, takich jak różne modele chorób neurologicznych i ortopedycznych u wielu gatunków zwierząt. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ analiza biomechaniczna wymaga znacznej ilości czasu i cierpliwości, a do rozwiązywania problemów w analizie danych niezbędna jest zaawansowana wiedza z zakresu biomechaniki. Metodologia ta jest stosowana u wielu gatunków od kilku dziesięcioleci, jednak dopiero niedawno stała się dostępna do użytku u gryzoni dzięki komercyjnie dostępnemu sprzętowi. Pierwszym krokiem w pomiarze zdolności lokomocyjnych szczurów jest przeszkolenie każdego zwierzęcia w przechodzeniu przez zamknięty tor o płaskiej powierzchni.

Po otrzymaniu szczurów od odpowiedniego dostawcy zwierząt, zwierzęta powinny zostać poddane aklimatyzacji w nowym środowisku przez jeden tydzień. W czasie aklimatyzacji do klatki szczura należy umieścić kilka płatków Cheerios.

Zwierzęta są codziennie poddawane restrykcji kalorycznej do poziomu zapotrzebowania energetycznego niezbędnego do utrzymania masy ciała, aby zapobiec otyłości i zapewnić późniejszą motywację do wykonywania zadania. Przez jeden tydzień, każdego dnia w tym samym przedziale czasowym, należy oswoić każde zwierzę przez 10 do 15 minut, umieszczając je w tunelu z płatkami Cheerios znajdującymi się na obu końcach. Gdy zwierzęta zapoznają się z otoczeniem, zaczną spożywać płatki Cheerios.

Gdy zwierzę poczuje się swobodnie, jedząc Cheeriosy wewnątrz toru, należy poddać je warunkowaniu instrumentalnemu, aby przebiegało całą długość toru w zamian za nagrodę pokarmową. Osiąga się to poprzez rzucenie jednej czwartej pierścienia Cheerios na przeciwległy koniec toru, na którym znajduje się szczur. Gdy szczur zje ten fragment, należy umieścić kolejną jedną czwartą pierścienia na drugim końcu toru.

Powtarzaj tę czynność do momentu, aż szczur będzie konsekwentnie poruszał się wzdłuż bieżni ze stałą prędkością kłusa, aby zjeść płatek cheerio, bez galopowania lub skakania. Warunkowanie zwierząt do tego zadania może prowadzić do wystąpienia chodu galopującego i skaczącego, które pod względem biomechanicznym są trudniejsze do interpretacji. Teraz zobaczmy, jak przeprowadzić znakowanie pozycji stawów.

Analiza kinematyki kończyn jest niewiarygodna ze względu na silnie skuloną posturę i wynikający z tego artefakt ruchu skóry spowodowany umieszczeniem markerów skórnych na czterech kończynach. Zamiast tego kinematykę kończyn przednich należy przeprowadzić za pomocą kinematografii rentgenowskiej lub fluoroskopii. W związku z tym niniejsze wideo będzie dotyczyło wyłącznie rozmieszczenia markerów pozycji stawów kończyn tylnych.

Po znieczuleniu zwierzęcia należy ogolić kończyny tylne oraz grzbiet do poziomu grzebieni biodrowych. Następnie zwierzę ułożone jest w pozycji grzbietowej, a jego kończyny tylne ustawia się w przybliżonej pozycji stojącej, wykorzystując twardą piankę mocującą do stabilizacji. Za pomocą nietoksycznego permanentnego markera należy zaznaczyć: najbardziej kranialne części grzebieni biodrowych, trochanter większy kości udowej, guz boczny piszczeli, staw skokowy oraz dystalny i boczny aspekt piątej kości śródstopia.

Wymagane jest codzienne odświeżanie wcześniej zaznaczonych punktów orientacyjnych anatomii, ponieważ szczury powoli usuwają znaczniki w wyniku naturalnych zachowań pielęgnacyjnych. Przejdźmy teraz do sposobu rejestrowania danych. Umieść objętość kalibracyjną w wyznaczonym obszarze toru biegowego.

Z każdej z kamer rejestrowana jest pojedyncza klatka objętości kalibracyjnej w obrębie bieżni. Przed rozpoczęciem sesji nagrywania należy sprawdzić obraz z każdej kamery. Należy upewnić się, że pole widzenia jest identyczne dla wszystkich czterech kamer i obejmuje platformę dynamometryczną w centrum oraz odcinek bieżni wystarczająco długi, aby zarejestrować dwa kroki.

Wszystkie skalibrowane oznaczenia wzdłuż każdego z drążków zostają zdigitalizowane. Ten etap kalibracji jest krytyczny przed rozpoczęciem zbierania danych. Jeśli kalibracja nie zostanie przeprowadzona dokładnie lub nie odbędzie się bezpośrednio przed sesją nagraniową, wszystkie uzyskane dane będą niedokładne i bezużyteczne.

Dopiero po uzyskaniu satysfakcjonującego poziomu błędu digitalizacji należy przystąpić do zbierania danych lokomocyjnych bezpośrednio przed umieszczeniem zwierzęcia w tunelu biegowym. Należy zapisać jego masę ciała i przykleić stożkowe odblaskowe markery skórne do wcześniej wyznaczonych punktów na topograficznych punktach orientacyjnych kończyn tylnych. Po umieszczeniu markerów na kończynach tylnych należy usiąść przy komputerze i przygotować marker zdarzeń podłączony do systemu silników Vicon.

Używając pliku z kalibracją jako szablonu, należy utworzyć kilka plików przed rozpoczęciem rejestracji. Zazwyczaj wymagane jest od 25 do 30 plików, aby zapewnić zgromadzenie wystarczającej liczby przebiegów, spełniających kryteria włączenia, oraz pomiarów prędkości. Po utworzeniu plików można rozpocząć zbieranie danych.

W pierwszej kolejności zachęć szczura do przemieszczania się wzdłuż bieżni, rzucając ćwiartki płatków Cheerios na oba końce bieżni, dbając o odpowiednią koordynację i wyczucie czasu. Marker zdarzenia jest aktywowany w momencie rozpoczęcia oraz tuż przed pomyślnym pokonaniem bieżni przez szczura. Po przeanalizowaniu surowej reakcji podłoża oraz zapisu siły i odnotowaniu, czy płyta pomiarowa została uderzona przez kończyny lewe czy prawe, zapisz i zamknij plik.

Należy zarejestrować równą liczbę uderzeń platformy siłową lewą i prawą kończyną. Proces rejestracji danych z danego przebiegu jest powtarzany do momentu zarejestrowania wystarczającej liczby przebiegów. Przejdźmy teraz do analizy danych z przebiegów; po zakończeniu gromadzenia danych dotyczących kinematyki i sił reakcji podłoża, każdy przebieg każdego zwierzęcia musi zostać oceniony pod kątem prędkości przy użyciu oprogramowania Vicon Modus i dwóch względnie stałych markerów.

Na przykład skrzydła kątnicy mogą zostać wykorzystane do oceny wirtualnego punktu pomiędzy markerami. W ten sposób można obliczyć prędkość tego wirtualnego punktu w kierunku poziomym; do analizy włączone są wyłącznie serie biegów, w których zwierzę poruszało się z prędkością od 60 do 90 cm/s. Do analizy wymagane jest minimum 10 serii.

Pięć serii, w których lewa kończyna styka się z platformą dynamometryczną, oraz pięć serii, w których prawa kończyna styka się z platformą dynamometryczną. Po zidentyfikowaniu akceptowalnych serii dla każdego zwierzęcia należy przeprowadzić digitalizację pozostałych markerów skórnych w celu skompensowania ruchu skóry. Estymacja pozycji kolana z uwzględnieniem artefaktów ponadkolanowych jest obliczana z wykorzystaniem triangulacji oraz kątów w stawach biodrowych, kolanowych i H.

Określa się prędkości i przyspieszenia, a także można ocenić czasy fazy podparcia i fazy przeniesienia. Równocześnie zebrane dane dotyczące siły reakcji podłoża są analizowane przy użyciu tego samego oprogramowania, co pozwala na obliczenie wielu zmiennych dla sił w każdym z trzech kierunków ortogonalnych. Równocześnie zebrane dane dotyczące siły reakcji podłoża są analizowane przy użyciu tego samego oprogramowania, co pozwala na obliczenie wielu zmiennych dla sił w każdym z trzech kierunków ortogonalnych.

W dalszej części przedstawimy reprezentatywne wyniki obrazujące użyteczność tej formy analizy lokomocji. Kinematykę oraz siły reakcji podłoża określono dla młodych, w średnim wieku i geriatrycznych samic szczurów Wistar. Na podstawie tej analizy stwierdzono różnice związane z wiekiem u samic szczurów Wistar.

W szczególności analiza siły reakcji podłoża wykazuje, że szczury geriatryczne mają obniżoną zdolność hamowania czterema kończynami i wykazują tendencję do częstszego wykorzystywania kończyn tylnych do stabilizacji bocznej w porównaniu z pozostałymi grupami zwierząt, natomiast analiza kinematyczna nie ujawniła żadnych istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupami. Dowodzi to, że dane kinematyczne można z łatwością zarejestrować u szczurów w niemal każdym wieku. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zważyć zwierzę bezpośrednio przed lub bezpośrednio po zebraniu danych oraz starannie skalibrować system przed rozpoczęciem pomiarów zgodnie z opisaną procedurą.

Do odpowiedzi na dodatkowe pytania można wykorzystać inne metody, takie jak kliniczna elektrofizjologia całego organizmu. Przykładowo, czy wyniki dotyczące kinematyki i siły reakcji podłoża są powiązane z regeneracją neuronów, czy raczej z jakąś inną, szerszą formą plastyczności neuroanatomicznej, na przykład w przypadku regeneracji nerwów obwodowych? Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak zbierać dane dotyczące siły reakcji podłoża oraz kinematyki kończyn tylnych u szczurów w swobodnym zachowaniu przy użyciu komercyjnie dostępnego sprzętu.