Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie mikrokrążenia w mózgu myszy za pomocą mikroskopii intravitalnej, która umożliwia śledzenie dynamicznych zmian markerów hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu w dłuższych okresach czasu. Technika ta została opracowana w La Jolla Bioengineering Institute, gdzie wykorzystano ją w wielu rodzajach badań. Przykładowo, do monitorowania zmian hemodynamicznych w przebiegu infekcji plasmodium burgi onca oraz w czasie występowania malarii mózgowej.

Osiąga się to najpierw poprzez implantację przewlekłego okna czaszkowego na dwa tygodnie przed badaniami z wykorzystaniem mikroskopii intravitalnej. Drugim krokiem procedury jest zarejestrowanie ogólnej morfologii okna czaszkowego za pomocą cyfrowego obrazu o wysokiej rozdzielczości przy niskim powiększeniu. Trzecim krokiem procedury jest pozyskanie obrazów z mikroskopii intravitalnej przy użyciu oświetlenia konwencjonalnego i fluorescencyjnego oraz wybór konkretnych obszarów badawczych do pomiarów w czasie rzeczywistym średnicy naczyń i prędkości RBC.

Ostatnim krokiem procedury jest przeprowadzenie analizy intravitalnej przylegania leukocytów i płytek krwi w naczyniach pialnych przy użyciu specyficznych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące in vivo zmiany w mikrokrążeniu mózgowym w modelach odzwierciedlających warunki fizjologiczne, patofizjologiczne lub chorobowe za pomocą intravitalnej mikroskopii mózgu, aby określić zmiany hemodynamiczne związane z tymi stanami. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji mózgu w jego fizjologicznym środowisku, bez narażania go na działanie czynników zewnętrznych lub sztucznych mediów; mikroskopia intravitalna, w porównaniu z rezonansem magnetycznym i angiografią, charakteryzuje się rozdzielczością przestrzenną i czasową, która pozwala na obserwację na poziomie mikroskopowym.

Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące fizjologii i patofizjologii mikrokrążenia mózgowego, takie jak zmiany hemodynamiczne i zapalne podczas ostrej i przewlekłej choroby. Na dwa do trzech tygodni przed mikroskopią wewnątrzżyciową u myszy w wieku od 8 do 10 tygodni przeprowadza się kraniotomię zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, z wyjątkiem tego, że w głowie zwierzęcia nie umieszcza się tytanowego pręta. Przewlekłe okno czaszkowe jest stabilnym preparatem, umożliwiającym badanie mikrokrążenia mózgu nawet kilka miesięcy po implantacji w dniu przeprowadzenia eksperymentu.

Najpierw należy zmierzyć temperaturę ciała zwierzęcia, a następnie umieścić je w aparacie stereotaksycznym i wprowadzić wcześniej przygotowane, znakowane fluorescencyjnie erytrocyty przez żyłę ogonową myszy. Umożliwi to śledzenie erytrocytów, co zostanie zademonstrowane w dalszej części. Następnie mysz należy lekko znieczulić izofluranem.

4% do indukcji, od 1 do 2% do podtrzymania. Następnie umieść zwierzę w pozycji brzusznej w ramie stereotaksycznej na podkładce grzewczej. Ostrożnie unieruchom głowę za pomocą prętów usznych i wyreguluj poziom za pomocą dźwigni prawej i lewej.

Delikatnie oczyść szkiełko nakrywkowe okna czaszkowego za pomocą patyczka higienicznego zwilżonego olejem mineralnym. Następnie, używając stereomikroskopu podłączonego do kamery cyfrowej, wykonaj kilka zdjęć panoramicznych naczyń znajdujących się pod oknem. Po przesłaniu zdjęć panoramicznych na komputer wybierz najlepsze z nich, aby je wydrukować, zidentyfikować i opatrzyć datą.

To zdjęcie zostanie wykorzystane jako mapa do pomiarów średnicy naczyń oraz prędkości erytrocytów, co zostanie zademonstrowane w dalszej części przed rozpoczęciem mikroskopii wewnątrzorganizacyjnej. Przenieś mysz na dostosowany stolik mikroskopu do obrazowania intravitalnego. Nanieś kroplę wody na okno czaszkowe, wykorzystując zagłębienie utworzone przez akryl dentystyczny.

Użyto obiektywu imersyjnego 20x o aperturze numerycznej 0,5. Obrazy rejestrowano za pomocą dwóch kamer: cyfrowej kamery o wysokiej czułości i dużej prędkości, podłączonej do komputera i monitora, oraz analogowej kamery o wysokiej czułości, podłączonej do magnetowidu VCR, generatora znaczników czasu i monitora kolorowego. Przed wybraniem naczyń do pomiaru należy sprawdzić naczynia w celu oceny jakości preparatu oraz upewnić się, czy w ich wszystkich przepływa krew; następnie należy wybrać naczynia do pomiaru. Powinny one obejmować żyły i tętnice o różnych średnicach i znajdować się w różnych miejscach obszaru odsłoniętego przez okno.

W naszym eksperymencie wybieramy 12 naczyń do pomiaru, przeglądając różne pola w obrębie okna czaszkowego. Aby wybrać naczynia, należy zaznaczyć dokładną lokalizację każdego punktu do pomiaru na zdjęciu unaczynienia PY wykonanym wcześniej dla każdego punktu; średnicę naczynia mierzy się za pomocą urządzenia do ścinania obrazu. Po wybraniu punktu obraz naczynia jest ustawiany w pozycji pionowej, a następnie obraz jest ścinany aż do przeciwległego brzegu.

Wyrównano wartości ekstremalne i odnotowano odczyt. W celu śledzenia erytrocytów każda plamka jest rejestrowana przez kamerę cyfrową przez co najmniej 30 sekund, a obrazy wideo są zapisywane z częstotliwością 150 klatek na sekundę. Tempo to ustawiono w celu uzyskania od jednej do sześciu obrazów komórki na jednej klatce wideo, co pozwala na wyznaczenie prędkości do 6 mm/s.

Po zakończeniu zbierania danych należy wyjąć mysz z aparatu stereotaksycznego i przenieść ją z powrotem do klatki, aby mogła dojść do siebie po znieczuleniu, korzystając z odpowiedniego oprogramowania. Uzyskane obrazy wideo są digitalizowane, a następnie pozyskiwane są dane o współrzędnych XY dla obrazu każdej komórki. Pozycje komórek są wyznaczane ręcznie, a nie za pomocą analizy obrazu.

Biorąc pod uwagę, że oko doświadczonego obserwatora pozwala na dobrą ocenę położenia centrum komórki, które zazwyczaj odpowiada miejscu zaobserwowanej maksymalnej fluorescencji. Dla większości orientacji komórek pomiary pozycji i prędkości wykonuje się dla 15 komórek w każdym naczyniu. Po uzyskaniu pomiarów średnicy naczynia oraz prędkości RBC wyciąga się średnią w celu otrzymania średniej prędkości RBC.

Obliczenie przepływu krwi w każdym naczyniu może być wykonane przy użyciu wzoru Q równe D przez dwa do kwadratu razy PI razy V, gdzie Q oznacza przepływ krwi, V oznacza prędkość RBC, a D oznacza średnicę naczynia, w celu oceny perfuzji i analizy adhezji leukocytów w naczyniach włosowatych. Mikroskopię witalną przeprowadza się u zwierzęcia, któremu podano mieszaninę albuminy znakowanej FSE oraz przeciwciał przeciwko panleukocytowemu markerowi CD 45 znakowanych Texas Red. Albumina znakowana fluorescencyjnie umożliwia lepszą wizualizację sieci naczyniowej, w tym naczyń penetrujących i jest szczególnie użyteczna w stanach chorobowych, takich jak malaria mózgowa, w celu sprawdzenia obecności naczyń nieperfundowanych lub słabo perfundowanych.

Przeciwciała anty-CD 45 znakowane fluorescencyjnie ułatwiają identyfikację i kwantyfikację toczucia oraz adhezji leukocytów do naczyń włosowatych. Kwantyfikacja adhezji leukocytów odbywa się poprzez zliczanie liczby leukocytów na odcinku naczynia o długości 100 µm. Toczanie jest kwantyfikowane poprzez zliczanie liczby leukocytów poruszających się z prędkością znacznie niższą niż prędkość przepływu krwi na tym samym odcinku 100 µm w ciągu 30 sekund. Przedstawiono.

Oto przykład pomiarów prędkości erytrocytów w naczyniach mikrokrążenia za pomocą śledzenia komórek w fluorescencyjnym obrazowaniu wysokiej częstotliwości. Nagrania wideo od A do F stanowią sekwencję obrazów mikrokrążenia. Każdy obraz przedstawia pozycję pojedynczego płynącego erytrocytu, rejestrowanego klatka po klatce przez kamerę wysokiej częstotliwości.

Wykres z reprezentatywnego eksperymentu przedstawia zmiany przepływu krwi w obrębie stosu w czasie. U myszy zainfekowanych plasmodium, burgi oraz onca, w przeciwieństwie do myszy kontrolnych niezainfekowanych, u których przepływ krwi w stosie pozostaje stosunkowo stabilny w czasie, u myszy zainfekowanych PBA obserwuje się znaczny spadek przepływu krwi w momencie rozwoju malarii mózgowej.

W szóstym dniu barwienie przeciwciałami anty-CD45 znakowanymi fluorescencyjnie Texas Red ujawnia liczne leukocyty przylegające do naczyń włosowatych myszy zakażonej Plasmodium berghei onca. Procedura ta znajduje szerokie zastosowanie poza zakresem prezentowanego tutaj zadania. Do niniejszego modelu można dostosować każdą technikę optyczną możliwą do zastosowania in vivo, co pozwala na badanie takich parametrów jak utlenowanie tkanek, pH tkanek, reaktywne formy tlenu oraz interakcje śródbłonka z leukocytami.