Metoda obrazowania przepływu krwi w neokorze za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe

Zdolność do obrazowania naczyń krwionośnych mózgu i rejestrowania dynamiki przepływu krwi w nienaruszonym mózgu żywych gryzoni jest potężną techniką, którą można zastosować w badaniach niedokrwienia mózgu lub prawidłowej fizjologii mózgu. Poniżej zademonstrujemy, jak wykorzystać dwie metody mikroskopii foto do obrazowania dynamiki przepływu krwi w nowokorze żywych myszy przy użyciu barwników fluorescencyjnych wstrzykiwanych do żyły ogonowej. Technika ta została pierwotnie opracowana przez Davida Kleinfelda oraz Winfreda Danka.

Cześć, jestem Ricardo Mota z Laboratorium Carlosa Portera Cayo w Katedrze Neurologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. W poprzednim filmie przedstawiliśmy metodę implantacji okna czaszkowego do chronicznych eksperymentów obrazowych in vivo. Dziś zaprezentujemy procedurę obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze mózgowej poprzez okno czaszkowe.

Przygotowanie to jest bardzo użyteczne, ponieważ umożliwia obrazowanie głębokich struktur mózgu przy użyciu dwufotonowej mikroskopii laserowej. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby obrazować naczynia krwionośne mózgu, zwierzęta muszą otrzymać dożylnie wstrzyknięty barwnik fluorescencyjny.

Stosujemy barwniki sprzężone z dekstranem, ponieważ cząsteczka dekstranu zapobiega przenikaniu barwnika przez barierę krew-mózg oraz jego wyciekowi z naczyń krwionośnych. Myszy znieczula się izofluranem w stężeniu 4% podczas indukcji oraz 1,5 do 2% w trakcie wstrzykiwania. Następnie ogon dezynfekuje się trzema tamponami z 70% alkoholu, a za pomocą igły 26G wstrzykuje się do żyły ogonowej od 75 do 100 µL 5% roztworu Rodamine Dextran rozpuszczonego w soli fizjologicznej.

W połowie długości ogona zwierzęta mogą być obrazowane bezpośrednio po wstrzyknięciu do żyły ogonowej, aż do momentu wydalenia barwnika z moczem, który w przypadku zastosowania barwnika ERO domine przybierze różowy kolor. Około dwie godziny po wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika Dextera mysz poddawana jest anestezji izofluranem: w stężeniu 4% podczas indukcji oraz od 1 do 1,5% podczas obrazowania. Mysz jest mocno przymocowana za pomocą tytanowego pręta do stolika mikroskopu, który jest wyposażony w termoregulatorowaną podkładkę grzewczą w celu utrzymania ciepła ciała zwierzęcia.

Nanoszona jest maść do oczu, aby utrzymać ich wilgotność. Szkiełko nakrywkowe okna czaszkowego jest czyszczone 70% alkoholem. Okno jest ustawiane równolegle do płaszczyzny ogniskowej i centrowane w polu widzenia.

Przy użyciu obiektywu 4x najlepiej wykonać fotografię naczyń powierzchniowych mózgu za pomocą aparatu cyfrowego. Zdjęcie to będzie służyć jako obraz referencyjny w kolejnych sesjach obrazowania, aby każdego dnia odnajdywać ten sam obszar obrazu. Następnie obiektyw 4x zastępuje się obiektywem imersyjnym w wodzie 40x.

Bez przesuwania stolika wykonuje się cyfrowe zdjęcie widoku. Następnie współrzędne manipulatora stolika zostają ponownie ustawione na zero. Jako oprogramowanie do akwizycji obrazu wykorzystujemy program scan image.

Program ten został napisany w środowisku MATLAB przez Toma Paula Rudo i Bernardo Sabatiniego w laboratorium Carls Voto. Następnie włączamy całą pozostałą aparaturę: laser, miernik mocy, fotopowielacze, wzmacniacze i tym podobne. Obszar okna nadający się do obrazowania jest krótko skanowany przy niskim powiększeniu w celu znalezienia najlepszych regionów.

Po ich zidentyfikowaniu wykonuje się stos obrazów o niskim powiększeniu wybranego obszaru do obrazowania i zapisuje jego współrzędne XY, aby zarejestrować dynamikę przepływu krwi w małych naczyniach lub kapilarach. Wykonujemy skany liniowe wzdłuż co najmniej 40 µm interesującego nas naczynia. Pojedyncze przejścia trwające jedną sekundę są realizowane przy użyciu jak najmniejszej mocy lasera, a współrzędne i kąt skanowania zostają zapisane.

Po zakończeniu sesji obrazowania zwierzę zostaje przeniesione do ciepłej komory, w której może dojść do niego do procesu wybudzania z narkozy. Przedstawiamy tutaj stos stu obrazów wykonanych co 5 µm za pomocą mikroskopu dwufotonowego przez okno czaszkowe umieszczone nad korą somatosensoryczną pięciomiesięcznej myszy, której do żyły ogonowej wstrzyknięto r Domine dextran. Ta sekwencja obrazów ukazuje złożoną sieć dużych i małych naczyń krwionośnych, w tym kapilar.

Przedstawiliśmy metodę wizualizacji dynamiki przepływu krwi in vivo poprzez okno czaszkowe. Jest to niezwykle skuteczna metoda obrazowania dynamiki przepływu krwi mózgowej w naczyniach korowych, na przykład do badania zmian w przepływie krwi po udarze. Dzięki wielokrotnym iniekcjom fluorescencyjnego barwnika do żyły ogonowej można przeprowadzać wielokrotne obrazowanie w różnych odstępach czasu.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o pracy w jak najczystszych i najbardziej sterylnych warunkach oraz o zachowaniu wyjątkowej precyzji ruchów dłoni. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.