Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Ogólnym celem tej procedury jest zminimalizowanie degradacji obrazów biologicznych spowodowanej obecnością przestrzeni powietrznych w liściach roślin, aby uzyskać wyraźniejsze obrazy żywych komórek wewnątrz liścia. Jeśli liść zostanie zamocowany w wodnym medium montażowym i fluorofor zostanie wzbudzony laserem, liczne niezypełnione przestrzenie powietrzne oraz zmiany współczynnika załamania światła w obrębie tkanki (pokazane na pomarańczowo) ograniczają siłę sygnału pochodzącego z głębszych warstw tkanki na otrzymanym obrazie. Jeśli natomiast liść zostanie zamocowany w perfluorodekalinie (PFD), wynikające z tego wzbudzenie laserowe fluoroforu jest w mniejszym stopniu tłumione, co pozwala na lepszą transmisję emitowanych sygnałów.

Ostatecznie, zastosowanie skaningowej mikroskopii konfokalnej z użyciem medium montażowego PFD pozwala na uzyskanie wyraźnych obrazów żywych komórek wewnątrz liścia rośliny na głębokości ponad dwukrotnie większej niż w przypadku zastosowania wodnego medium montażowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fiksacja, montowanie liści czy stosowanie mediów wodnych, jest redukcja refrakcji w obrębie mezofylu, co umożliwia dokładniejsze obrazowanie żywych komórek w głębszych warstwach liścia, co dotychczas stanowiło problem. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu nauk o roślinach, takie jak biologia komórek mezofylu i sygnalizacja in vivo, kolonizacja liści przez patogeny oraz interakcje z patogenami; tym samym metoda ta może dostarczyć wglądu w fundamentalną biologię roślin.

Metodę tę można zastosować również do innych tkanek o wysokim współczynniku załamania światła, bogatych w przestrzenie powietrzne, takich jak spirale ślimaków lub płuca kręgowców. Procedurę tę zaprezentuje dr George Littlejohn z mojego laboratorium To Mount Leaf. Próbki w PFD przygotowuje się od sporządzenia preparatu mikroskopowego z przepuszczalną dla gazów uszczelką z polidimetylosiloksanu lub P-D-M-S; P-D-M-S jest polimerem wiskoelastycznym, który można formować w celu stworzenia komory dostosowanej do wymagań eksperymentalnych.

Nasyć PFD powietrzem, wstrząsając niewielką objętością PFD w wypełnionej powietrzem butelce. Można to również osiągnąć poprzez przepuszczanie pęcherzyków powietrza przez PFD. Następnie przelej PFD do otwartej szalki Petriego i umieść całą siewkę lub wycięty liść na powierzchni cieczy na pięć minut. Tkanka powinna stać się półprzezroczysta, co przypomina tkankę zwitryfikowaną.

Liście mogą wydawać się ciemniejsze lub jaśniejsze niż przed ekspozycją na PFD, w zależności od warunków oświetlenia i wieku użytej tkanki. Na koniec wypełnij komorę PDMS napowietrzonym PFD i ostrożnie przenieś próbki tkanki z szalki Petriego do inkubacji do komory PDMS. Zamknij preparat szkiełkiem nakrywką i wykonaj obrazowanie.

Zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi, liście miesięczne inkubowano przez pięć minut w zawiesinie rekombinowanego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Mikroskopowa inspekcja próbek liści inkubowanych w PFD wykazuje, że większość przestrzeni powietrznych jest wypełniona rekombinowanym GFP zawieszonym w PFD. GFP jest widoczny w kolorze zielonym, natomiast kolor czerwony reprezentuje chlorofil, autofluorescencję i komórki mezofila.

Widać, że liść zostaje całkowicie zanurzony podczas inkubacji w PFD, jednak mogą pozostać sporadyczne pęcherzyki powietrza. W tych warunkach woda nie wypełnia całkowicie przestrzeni w liściu. W niniejszym doświadczeniu liście opsys wykazujące ekspresję Venus, wariantu YFP lokalizującego się w cytosolu, są inkubowane i montowane w powietrzu, wodzie lub PFD do skanowania laserowego. Mikroskopia konfokalna próbek wykazuje przewagę PFD nad powietrzem i wodą, przy w przybliżeniu dwukrotnym zwiększeniu głębokości obrazowania.

W porównaniu z PFD i wodą, po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie od pięciu do 10 minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że perfluorodekalina rozpuszcza lakier do paznokci oraz Teflon, ale jest kompatybilna z smarem silikonowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać perfluorodekalinę jako medium montażowe w celu poprawy obrazowania w komórkach liści roślin.

Należy pamiętać, że mimo iż perfluorodekalina jest nietoksyczna, zalecamy stosowanie standardowych zasad bezpieczeństwa podczas przeprowadzania tej procedury.