Oznaczanie liczby komórek podczas hodowli komórkowej przy użyciu licznika komórek Scepter

Licznik komórek scepter to przenośne zautomatyzowane urządzenie służące do liczenia komórek, monitorowania ich średnicy i objętości oraz sprawdzania stanu zdrowia i jakości populacji komórkowych. Oferuje on istotne zalety w porównaniu z innymi metodami liczenia, w tym zwiększoną dokładność, łatwość obsługi oraz niski koszt liczenia komórek. Korzystając z urządzenia scepter, należy postępować zgodnie z instrukcjami na wyświetlaczu graficznym, aby pobrać komórki do jednorazowego sensora.

Następnie zlicza się komórki, a urządzenie raportuje ich stężenia oraz statystyki, które można przesłać do komputera i przeanalizować. Cześć, nazywam się Sonya. Jestem naukowcem w Millport i dzisiaj pokażę wam, jak korzystać z urządzenia scepter.

Licznik komórek Liczenie komórek jest niezbędnym, lecz żmudnym etapem hodowli komórkowych in vitro. Stałe stężenia komórek zapewniają powtarzalność i dokładność eksperymentów. Liczenie komórek jest istotne dla monitorowania stanu zdrowia i tempa proliferacji komórek, oceny komórek nieśmiertelnych lub transformowanych, wysiewania komórek do kolejnych doświadczeń, transfekcji lub infekcji, a także przygotowywania testów opartych na komórkach, przy jednoczesnej potrzebie szybkości i precyzji.

W badaniu dotyczącym liczenia komórek 71% z 400 ankietowanych badaczy wykonuje tę czynność przy użyciu komory countingowej (hemocytometru). Choć metoda ta jest niedroga, jest ona pracochłonna oraz podatna na błędy użytkownika i niewłaściwe zastosowanie, co prowadzi do niedokładnych wyników. Źródła błędów w hemocytometrii obejmują nierównomierny rozkład komórek w próbce oraz zbyt dużą lub zbyt małą liczbę komórek w próbce.

Subiektywne decyzje dotyczące tego, czy dana komórka znajduje się w obrębie zdefiniowanego obszaru zliczania. Zanieczyszczenie hemocytometru, różnice w sposobie postępowania użytkowników oraz zmienność szybkości napełniania hemocytometru, aby złagodzić monotonię związaną z ręcznym zliczaniem. 29% badaczy zlicza komórki przy użyciu zautomatyzowanych urządzeń do zliczania komórek.

Jednak dla większości badaczy cena związana z tymi dużymi urządzeniami laboratoryjnymi stanowi barierę w ich stosowaniu. Liczak komórek Scepter to zautomatyzowane urządzenie ręczne, które zapewnia automatyzację i dokładność zliczania komórek przy stosunkowo niskim koszcie w łatwej w obsłudze formie kompaktowej. System wykorzystuje zasadę Coultera w detekcji cząstek opartej na impedancji w zminiaturyzowanej formie, wykorzystując kombinację sprzętu analogowego i cyfrowego do przetwarzania sygnałów pomiarowych, przechowywania danych oraz wyświetlania graficznego.

Jednorazowy czujnik został zaprojektowany z mikrofabrykowaną strefą detekcji komórek, która umożliwia rozróżnianie komórek na podstawie ich wielkości i objętości z rozdzielczością submikronową i subpikolitrową, wspieraną przez precyzyjne kanały do prowadzenia cieczy oraz układ elektroniczny. Licznik komórek Scepter graficznie przedstawia statystyki populacji komórek w formie histogramu. Prace z licznikiem komórek Scepter rozpoczyna się od rozcieńczenia zawiesiny pojedynczych komórek w roztworze soli fosforanowej (PBS).

Optymalne stężenie wynosi od 10 000 do 500 000 komórek na mililitr. Przenieś 100 µL rozcieńczonych komórek do probówki typu microview o pojemności 1,5 mL. Włącz licznik komórek Scepter, naciskając i przytrzymując przełącznik z tyłu urządzenia, a następnie poczekaj na wyświetlenie instrukcji na ekranie.

Po wyświetleniu komunikatu, przymocuj czujnik do końca jednostki scepter, tak aby panel detekcyjny elektrody był skierowany w stronę przedniej części instrumentu. Czujniki scepter składają się z precyzyjnie formowanej komory próbkowania z elektroniczną strefą detekcyjną i zintegrowanymi elektrodami do detekcji komórek. Czujniki te umożliwiają rozróżnienie wielkości komórek z rozdzielczością submikronową oraz objętości komórek z rozdzielczością poniżej pikolitra.

Spójna konstrukcja sensora zapewnia przeliczanie równych objętości próbek oraz dokładne pomiary rozmiarów. Po zamocowaniu sensora należy wykonać każdy etap procesu liczenia zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w następujący sposób. Gdy na ekranie pojawi się komunikat „hold down the plunger to begin” (przytrzymaj tłok, aby rozpocząć), należy nacisnąć tłok; następnie na ekranie pojawi się komunikat „submerge the sensor” (zanurz sensor) – należy wtedy zanurzyć sensor w roztworze zawiesiny komórkowej, a następnie zwolnić tłok, aby wciągnąć zawiesinę komórkową do wnętrza sensora.

Tłok pełni rolę sygnału elektrycznego i zaciągnie próbkę wraz z objętością martwą do czujnika. Prędkość lub precyzja ruchu tłoka nie mają takiego znaczenia, jak w przypadku pipetowania. Proces ten potrwa kilka sekund po przygotowaniu urządzenia.

Urządzenie wyemituje sygnał dźwiękowy, a na ekranie pojawi się komunikat o załadowaniu próbki. Po wprowadzeniu próbki do czujnika zostanie ona przeprowadzona przez strefę pomiarową w celu oceny wielkości i objętości komórek. Następnie, po przejściu przez mikrokanały i odliczeniu 50 µL próbki, czujnik wyśle sygnał do urządzenia w celu zatrzymania liczenia.

Po zakończeniu zliczania na ekranie urządzenia pojawi się komunikat count complete. Należy wyjąć czujnik i go zutylizować. Postępuj zgodnie z instrukcją na ekranie, wyjmij czujnik i go zutylizuj.

Następnie urządzenie wyświetli na ekranie histogram wielkości lub średnicy komórek, a także stężenie komórek na mililitr. Po zakończeniu pomiaru i wyświetleniu histogramu na urządzeniu, należy zastosować bramki, naciskając przycisk przełącznika, a następnie wybrać auto gating lub use last, aby automatycznie ustawić bramkę na podstawie profilu histogramu lub użyć bramek z poprzedniego pomiaru. Niezależnie od wyboru, bramki można przesuwać ręcznie w celu ich precyzyjnego dostrojenia.

Dostrój dane, naciśnij ponownie przycisk przełącznika, aby wybrać bramkę lewą, a następnie przesuń przełącznik, aby ustawić bramkę w pożądanej pozycji. Następnie naciśnij przełącznik ponownie, aby aktywować bramkę prawą, i przesuń przełącznik, aby umieścić bramkę prawą. Kliknij ponownie.

Wyświetlone zostanie nowe stężenie komórek, średnia objętość oraz średnica komórek. Przełącznik może być przesunięty na dowolną stronę, aby zmienić widok między datą i godziną, średnim rozmiarem komórek a średnią objętością komórek; w pamięci instrumentu można zapisać do 72 histogramów. Aby przesłać dane na komputer osobisty, podłącz urządzenie za pomocą kabla USB, a następnie otwórz ekran wyświetlania w komputerze.

Kliknij dwukrotnie aplikację scepter, aby uruchomić oprogramowanie. Następnie kliknij przycisk połącz. Wszystkie wyniki zliczeń zostaną automatycznie przeniesione do programu.

Oprogramowanie aplikacyjne Scepter wyświetla histogram szczegółowo przedstawiający rozkład populacji hodowli w zależności od objętości lub średnicy. Pobrane pliki można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel, w którym surowe dane zostaną wyświetlone w przedziałach określonych średnic lub objętości komórek. Do liczenia przygotowano 19 różnych linii komórkowych, a teoretyczne stężenia początkowe określono za pomocą licznika komórek.

Następnie zawiesiny komórek poddano dalszemu rozcieńczeniu w celu uzyskania zawiesin o teoretycznych stężeniach komórek. Do wyznaczenia stężeń komórek wykorzystano licznik komórek Scepter. Rysunek przedstawia pięć rozcieńczeń zmierzonych dla pięciu reprezentatywnych linii komórkowych wraz z teoretycznym stężeniem komórek.

Wysoki stopień liniowości, wskazany przez wartości r-squared, dowodzi, że liczenie za pomocą scepter jest niezawodną metodą dla badanych linii komórkowych w szerokim liniowym zakresie pracy. Ogólną względną dokładność liczenia scepter wykazano tutaj poprzez porównanie danych uzyskanych z liczenia scepter z wynikami uzyskanymi z liczenia coter. Wykres logarytmu liczby komórek z licznika scepter w funkcji logarytmu liczby z licznika coter pokazuje, że we wszystkich badanych liniach komórkowych wyniki z licznika scepter są zgodne z wynikami z licznika coter.

Zliczanie 19 linii komórkowych przeprowadzono przy użyciu licznika Coulter Z two. Pomiary za pomocą licznika Scepter, zautomatyzowanego licznika obrazowego, takiego jak system V cell lub count oraz licznika hemo TER wykonano zgodnie z instrukcjami producenta, wykorzystując tę samą zawiesinę wyjściową komórek i identyczne rozcieńczenia. Wyniki przedstawione na tej rycinie wykazują, że stężenia komórek zmierzone za pomocą licznika Scepter ściśle odpowiadają teoretycznym stężeniom komórek przy wysokiej liniowości.

Współczynnik zmienności (CV), wyrażony w procentach, obliczono dla każdego rozcieńczenia każdej linii komórkowej. Dla każdego systemu liczenia przedstawiono średnie wartości procentowe CV dla 19 linii komórkowych w zależności od stężenia komórek i metody liczenia w zakresie operacyjnym. Licznik komórek Scepter jest bardziej precyzyjny niż liczenie za pomocą hemocytometru, wykazując mniejsze odchylenia standardowe i mniejsze średnie współczynniki zmienności.

Liczenie za pomocą Scepter jest 10 razy szybsze niż hemo-cytometria i szybsze niż w przypadku innych liczników automatycznych. Tutaj zliczony zostało 93 komórki SF nine, MCF seven oraz HC 2, stosując metody opisane w tym filmie. Odnotowano średni czas potrzebny na pomiar stężenia komórek.

Należy zauważyć, że cytometry krwi przeprowadzono tylko raz dla każdej próbki. Urządzenie Scepter wykonuje pomiary w oparciu o rozmiar komórek. W związku z tym wszelkie zmiany w morfologii komórkowej mogą zostać zarejestrowane na histogramie.

Zdrowe kultury wykazują prawidłowy rozkład Gaussa w kształcie dzwonu, natomiast niezdrowe komórki obumierają, co powoduje przesunięcie histogramu w lewo. Podobnie zaobserwowano przesunięcia histogramu w przypadku zmieszania populacji składającej się w 50% z martwych i w 50% z żywych komórek. Przedstawiłem właśnie sposób obsługi nowego licznika komórek Scepter firmy Millipore, który rewolucjonizuje sposób, w jaki badacze liczą komórki.