Liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych
22 sierpnia 2007
Znajomość dokładnej liczby żywych komórek jest niezbędna przy wielu manipulacjach w hodowlach tkankowych. Niniejszy protokół opisuje sposób rozróżniania komórek żywych od martwych oraz ilościowego oznaczania komórek przy użyciu hemacytometru. Choć opisano w nim liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs), można go zastosować również do innych typów komórek.
W tej części pokażę Państwu, jak zliczać ludzkie komórki prekursorowe neuronów. Zliczanie komórek jest konieczne przed ich przygotowaniem do immunocytochemii lub w przypadku przeprowadzenia transfekcji za pomocą nukleofektora. Używam hemocytometru z kontrastem fazowym, który posiada siatkę pomiarową, a także barwnika o nazwie błękit trypanu. Barwnik ten jest przydatny, ponieważ pozwala odróżnić komórki żywe od martwych.
Martwe lub obumierające komórki pochłaniają ten barwnik i wykazują niebieskie zabarwienie. Podczas obserwacji komórek w hematometrze komórki żywe są w stanie wykluczyć ten barwnik i nie barwią się na niebiesko. W ten sposób można określić żywotność komórek, przygotowując roztwór błękitu trypanu w medium.
Do tej probówki typu epi o pojemności 0,5 ml dodam 20 µL roztworu trypanu i błękitu. Następnie dodam 25 µL pożywki. W ten sposób mam obecnie 45 µL roztworu trypanu, błękitu i pożywki, dzięki czemu po dodaniu 5 µL zawiesiny komórkowej uzyskam rozcieńczenie 1:10.
W związku z tym dodam teraz 5 µL zawiesiny komórkowej. Najpierw upewnię się, że komórki zostały dobrze resuspensowane poprzez delikatne potrząsanie opuszkami palców. Chcę teraz upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany.
W związku z tym będę kilkukrotnie przesuwać zespół z próbkami w górę i w dół. Na koniec naniosę około 12 µL tej zawiesiny komórkowej do hemocytometru. Posiada on dwa otwory i można skorzystać z dowolnego z nich.
Wystarczy zatem wprowadzić roztwór przez ten port, a ciecz zostanie zassana dzięki działaniu kapilarnemu. Teraz mogę przystąpić do liczenia. Oto widok komory Bürchera przy powiększeniu 10x; widzimy tutaj kwadrant zawierający 16 pól.
Jak widać, możemy tutaj zaobserwować komórki żywe i martwe. Tutaj mamy komórki żywe, takie jak ta, ta i ta. Mamy również niektóre komórki martwe, na przykład tę.
Jak widać, martwa komórka jest ciemnoniebieska, natomiast żywe komórki są otoczone swoistym ореolem. Teraz policzę wszystkie żywe komórki, przesuwając się od lewej do prawej i od góry do dołu.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Zatem w tej ćwiartce mamy łącznie trzydzieści sześć komórek. Aby zachować spójność, komórki znajdujące się na granicy ćwiartki, na przykład wzdłuż tej linii tutaj, liczę jako znajdujące się na lewej i górnej krawędzi.
Konsekwentnie zliczam komórki na tych krawędziach dla wszystkich kwadrantów komory licznikowej. Teraz obliczymy, ile komórek mamy na mikrolitr. W tym celu wyciągnę średnią liczbę komórek na kwadrant, która wynosi 38, i pomnożę ją przez 10, czyli współczynnik wynikający z wymiarów komory.
Następnie pomnożymy wynik przez 10, co w tym przypadku jest naszym współczynnikiem rozcieńczenia. W rezultacie otrzymamy liczbę komórek na mikrolitr. W tym przypadku jest to 3 800 komórek na mikrolitr.
Ponieważ zawiesiliśmy osad komórkowy w 500 µL roztworu, można obliczyć całkowitą liczbę komórek. To wszystko.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę zliczania ludzkich komórek macierzystych/prekursorowych układu nerwowego (hNSPCs) przy użyciu hemacytometru. Podkreśla on znaczenie rozróżnienia między komórkami żywymi a martwymi w różnych zastosowaniach związanych z hodowlą tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Hodowla tkanek
Wstęp
- Liczba żywych komórek jest kluczowa dla manipulacji w hodowlach tkankowych.
- Żywe komórki potrafią wykluczać określone barwniki, podczas gdy martwe komórki nie posiadają tej zdolności.
- Hemacytometr jest standardowym narzędziem do liczenia komórek.
- Barwnik błękit trypanu jest powszechnie stosowany do oceny żywotności komórek.
Cel badania
- Zapewnienie wiarygodnej metody zliczania hNSPCs.
- Skuteczne różnicowanie komórek żywych i martwych.
- Wsparcie badaczy w przygotowaniu do dalszych eksperymentów, takich jak immunochemia lub transfekcja.
Zastosowane metody
- Użycie hemacytometru z kontrastem fazowym.
- Zastosowanie barwnika trypan blue w celu określenia żywotności komórek.
- Liczenie komórek pod mikroskopem.
- Przygotowanie roztworu trypan blue i pożywki.
Główne wyniki
- Skuteczne odróżnienie komórek żywych od martwych.
- Dokładne ilościowe oznaczenie hNSPCs.
- Wykazanie skuteczności barwnika trypanu niebieskiego.
- Walidacja hemacytometru jako niezawodnej metody liczenia.
Wnioski
- Protokół zapewnia prosty sposób liczenia komórek.
- Ma on zastosowanie do różnych typów komórek, nie tylko do hNSPCs.
- Zrozumienie żywotności komórek jest niezbędne dla powodzenia eksperymentów z hodowlami tkankowymi.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładna kwantyfikacja żywych ludzkich komórek macierzystych/prekursorowych neuronów (hNSPCs) jest niezbędna dla powtarzalności procesów hodowli tkankowej w badaniach nad nowymi lekami w neurologii. Niniejszy protokół umożliwia wiarygodną ocenę żywotności komórek oraz pomiar ich stężenia, co zapewnia spójne wysiewanie materiału do dalszych zastosowań, takich jak immunocytochemia i transfekcja. Dzięki standaryzacji rozróżniania komórek żywych i martwych przy użyciu błękitu trypanu oraz zliczania za pomocą hemacytometru, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w rurach procesowych wczesnej walidacji celów i rozwoju testów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia precyzyjne wysiewanie hNSPC do badań nad zaangażowaniem celu i modulacją szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zmienność w testach opartych na komórkach poprzez zapewnienie spójnej liczby żywych komórek wejściowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych dotyczących stężenia komórek, które są kluczowe dla standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalne przygotowanie zawiesin komórkowych dla formatów wysokoprzepustowego screeningu (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia spójność liczby komórek wejściowych w etapach przejścia od fazy odkrywania do badań przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia współpracę międzyzespołową dzięki standaryzacji praktyk liczenia komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania leków, zapewniając niezawodne przygotowanie komórek – od walidacji celu, poprzez optymalizację testów, aż po przedkliniczne badania skuteczności.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia dokładne dawkowanie komórek w eksperymentach walidacji celu z udziałem hNSPCs.
- Przesiewy: Dostarcza zestandaryzowane, mierzalne ilości komórek niezbędne do powtarzalnego wykonania analizy.
- Analityka: Generuje dane dotyczące stężenia żywych komórek i ich całkowitej liczby, wykorzystywane do normalizacji warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość w postępowaniu z komórkami pomiędzy etapem odkryć in vitro a modelami przedklinicznymi.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi przenaszalną, niskozłożeniową funkcjonalność, którą można zastosować w wielu typach komórek i projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Poprawia pewność prognostyczną poprzez minimalizację zmienności danych wejściowych w eksperymentach opartych na komórkach.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność i standaryzację pomiędzy laboratoriami i zespołami.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) dzięki niezawodnym podstawom analizy.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia postęp skorygowany o ryzyko poprzez zapewnienie jakości danych we wczesnych badaniach przesiewowych skuteczności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej biegłości w technice hodowli tkanek oraz w mikroskopii.
- Zależne od dostępności hemacytometru oraz jego właściwego oczyszczenia w celu uniknięcia kontaminacji.
- Wymaga spójnego przeszkolenia operatora w zakresie bezstronnego wyboru kwadratów oraz zasad liczenia komórek na granicach pól.
- Ograniczone przez przepustowość ręcznego liczenia; nieprzydatne do automatyzacji wysokoprzepustowej bez odpowiedniej adaptacji.
- Opiera się na prawidłowym rozcieńczeniu i wymieszaniu, aby zapewnić reprezentatywne próbkowanie zawiesiny komórkowej.
