Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie szybkiej i niezawodnej zautomatyzowanej konfiguracji macierzy opartych na qPCR. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie zestawów starterów do macierzy oraz przygotowanie mieszanin master mix próbek do przesiewu. Następnie wykorzystuje się zautomatyzowany robot do PCR lub system elektronicznych pipet matrycowych, aby precyzyjnie nanieść master mix próbek i zestawy starterów do każdego dołka płytki 384-dołkowej.

Po przygotowaniu, reakcje PCR w płytce 384-dołkowej przeprowadza się zgodnie z programem PCR dla urządzenia LightCycler 480. Ostatnim krokiem procedury jest analiza danych qPCR i określenie względnych poziomów ekspresji dla każdej przetestowanej pary starterów, z których każda jest skierowana przeciwko konkretnemu mRNA. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w ekspresji dużych zestawów mRNA.

Specjalnie opracowane macierze mogą zatem służyć do analizy pełnych profili pre-microRNA, konkretnych szlaków lub cząsteczek kluczowych dla infekcji wirusowej poprzez profilowanie oparte na qPCR. Witajcie, jestem Dirk DMA z Katedry Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przeprowadzić analizę qPCR w czasie rzeczywistym, prezentując dwie metody.

Jedna z nich z wykorzystaniem pipety manualnej, a druga z użyciem robota. Technologię tę stosujemy do pomiaru prekursorów microRNA oraz dojrzałych microRNA w ludzkich guzach nowotworowych. Dzisiejszą demonstrację przeprowadzą Pauline Chu i Kristen bu.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać płytki z primerami zawierające 186 par primerów w formacie 96-dołkowym o stężeniu 0.5 pM, przechowywane w temperaturze -20 °C.

Po rozmrożeniu płytek w temperaturze pokojowej, należy je krótko wymieszać w wirówce typu vortex i odwirować. Należy również rozmrozić mieszaninę PCR Cyber Green w temperaturze pokojowej; do przygotowania każdej płytki z primerami o 96 dołkach będą potrzebne cztery probówki z master mixem. Przygotować master mix, łącząc 4 µL mieszaniny Cyber Green, 3 µL wody do PCR oraz od 10 do 20 ng DNA próbki lub cDNA na reakcję w każdej z czterech probówek typu Eppendorf o pojemności 2 mL.

Każda probówka powinna zawierać wystarczającą ilość master mixu na około 100 reakcji, z uwzględnieniem nadwyżki na straty podczas pipetowania. Wymieszaj zawartość probówek typu einor za pomocą wortexa. Rozpocznij przygotowanie analizy prekursorowego mikroRNA przy użyciu robota Freedom Tecan EVO, inicjalizując robota i ładując program EVO wear.

Następnie przepłucz robota trzy razy 30 mililitrami płynu systemowego, aby usunąć z układu pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócić dokładność pipetowania. Następnie skonfiguruj platformę robota tak, aby zawierała płytkę 384-dołkową oraz płytkę z primerami 96-dołkową. Mieszaniny główne, korytko zawierające 2% bleach, pełny pojemnik z płynem systemowym oraz pusty pojemnik na odpady.

Rozpocznij automatyczny cykl pracy robota, wybierając opcję run dwukrotnie na końcu programu. Wyjmij płytkę 384-dołkową i uszczelnij ją folią LightCycler 480 ceiling foil. Następnie odwiruj płytkę w wirówce.

Krótko umieść zamkniętą płytkę 384-dołkową w pozycji pierwszej w hotelu. Następnie powtórz ten proces dla drugiej płytki z primerami, używając nowych mieszanin master mix oraz nowej płytki 384-dołkowej. Umieść otrzymaną zamkniętą płytkę 384-dołkową w pozycji drugiej w hotelu.

Otwórz nowy program EVO wear w celu załadowania cyklera świetlnego z hotelu i ustaw parametry cyklowania. Następnie wybierz uruchom dwukrotnie. System Freedom Evo automatycznie załaduje każdą płytkę do cyklera świetlnego i uruchomi program cyklowania HRM dla Cyber Green.

Po zakończeniu procesu należy przejrzeć i przeanalizować wyniki zgodnie z opisem w protokole pisemnym, jako alternatywę dla użycia robota. Do przeniesienia zawartości probówki z master mixem do zbiornika można użyć wielokanałowej pipety elektronicznej do płytek.

Ustaw pipetę elektroniczną na pobranie 16 µL master mixu z dwoma krokami dozowania po 8 µL, a następnie krokiem przedmuchania. Po ustawieniu pipety pobierz 16 µL master mixu i zacznij dozować go do płytki 384-dołkowej. Dozuj pierwsze 8 µL do co drugiego rzędu w kolumnie pierwszej, używając rzędów od A do O, pozostawiając następną kolumnę pustą.

Odmiar kolejne 8 µL do tych samych wierszy w kolumnie trzeciej. Następnie przedmuchaj pipetę nad pojemnikiem na odpady i wyrzuć końcówki, postępując zgodnie z tym schematem pomijania co drugiego wiersza i co drugiej kolumny. Powtórz tę procedurę na całej płytce przez kolejne pięć cykli w celu pipetowania master mix 2.

Wykorzystaj te same wiersze co w przypadku pierwszej mieszaniny master mix, ale zacznij od drugiej kolumny. Powtórz tę procedurę dla mieszanin master mix trzy i cztery, zaczynając odpowiednio od kolumny pierwszej i drugiej, ale tym razem używając rzędów od B do P płyty z primerami. Ustaw pipetę elektroniczną na pobranie 2 µL i dozowanie 2 µL z następującym po tym krokiem przepłukiwania.

Przenieś 2 µL starterów z kolumny pierwszej, wierszy od A do H płytki ze starterami o 96 dołkach, do co drugiego rzędu w kolumnie pierwszej płytki o 384 dołkach, przemywając pipetę nad pojemnikiem na odpady i utylizując końcówki. Powtórz ten schemat dla pozostałych trzech mieszanin głównych (master mixes) w kolumnach pierwszej i drugiej. Następnie kontynuuj ten proces dla kolumn od drugiej do 12. płytki ze starterami o 96 dołkach, przesuwając się co dwie kolumny w płytce o 384 dołkach dla każdej kolumny starterów.

Następnie szczelnie zamknij płytki za pomocą pokrywy cyklera, folii i odwiruj je w wirówce. Po krótkim wirowaniu umieść płytki w cyklerze LightCycler 480 i przeprowadź cykle zgodnie z formatem detekcji HRM dla barwnika SYBR Green I.

Stosując te same warunki cykliczne co poprzednio, powtórz tę procedurę, używając płytki z primerami dwa Eloqua w nowej płytce 384-dołkowej oraz świeżo przygotowanych mieszanin master mix. Sygnatury prekursorowych mikroRNA wyłaniają się poprzez profilowanie z wykorzystaniem nowej matrycy opartej na qPCR. Obliczono średnią wartość delta CT znormalizowaną do U6, a wartości ustandaryzowane wprowadzono do matrycy.

Oprogramowanie Minor generujące trzy wyraźne klastry przedstawione w formie map ciepła. Względna ekspresja każdego prekursora mikroRNA jest pokazana za pomocą kolorów czerwonego i niebieskiego, które reprezentują odpowiednio wzrost i spadek względnej ekspresji. Intensywność koloru wskazuje stopień zmiany ekspresji.

Większość prekursorów microRNA uległa niewielkim, nieistotnym zmianom, zgodnie z oczekiwaniami. Jednakże poziom niewielkiej części prekursorów microRNA znacząco wzrósł w trakcie trwania eksperymentu. Dodatkowo, względny poziom niektórych prekursorów microRNA gwałtownie spadł.

W niektórych przypadkach grupują się one również w analizie mapy ciepła. W zależności od eksperymentu mogą pojawić się klastry zależne od infekcji wirusowej, specyficznej dla typu komórek ekspresji prekursorowych microRNA lub prekursorowych microRNA regulowanych przez wspólną cząsteczkę bądź ścieżkę sygnalizacyjną.

Przedstawiono średnie progi cyklu (ct) dla próbki negatywnej pod kątem wirusa herpes powiązanego z mięsakiem Kaposiego, analizowanej w czterech powtórzeniach. Co istotne, w tej próbce nie wykryto antygenu jądrowego związanego z latencją wirusa herpes powiązanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV Lana) przy użyciu wysokoczułej macierzy QPCR. Jednakże zarówno kontrola wewnętrzna U six, jak i let seven a – silnie ekspresowany ludzki prekursor mikroRNA – wykazywały ekspresję na poziomach możliwych do wykrycia.

W końcu, zgodnie z oczekiwaniami, kontrola negatywna w postaci wody do PCR nie dała produktu A-Q-P-C-R. Przedstawiono analizę krzywej topnienia dla dwóch różnych starterów z wykorzystaniem tej samej dubletowej próbki.

Jasno widać, że temperatura topnienia różni się dla obu par starterów, jednak próbka topi się w dokładnie tej samej temperaturze dla każdej powtórki. Sygnały świadczące o złej jakości lub potencjalnie zanieczyszczonej próbce mogą obejmować kilka pików topnienia, co sugeruje obecność dwóch różnych źródeł materiału wejściowego. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przygotowania eksperymentów qPCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem robota.

Ważne jest, aby uwzględnić wszystkie kontrole oraz jak najwięcej genów referencyjnych. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.